本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双荧光素酶报告基因质粒的构建，该质粒可用于孤核受体活性调节剂筛选。
背景技术：
孤核受体是没有配体或尚未发现配体的核受体。目前，已发现了150余种孤核受体，有些孤核受体参与了动物体的代谢调节、胚胎发育、细胞分化和基因表达等。近年来，随着部分孤核受体活性调节剂的发现，尤其是内源性激动剂的发现，已发展成为配体依赖性核受体，如视黄酸x受体、法尼酸x受体、过氧化物酶体增生激活受体γ等。由此可见，孤核受体活性调节剂的发现不仅可以加深了我们对孤核受体作用的认识，而且还有助于靶向调控孤核受体类新药的开发。
孤核受体作用元件(hres,hormoneresponseelements)最先是在研究维生素d受体、甲状腺激素受体和维生素a受体等核受体作用时发现的。hres通常位于核受体的作用靶基因启动子序列中,孤核受体的dbd可识别并结合之。hres一般有两个重复性序列组成，致使dna与孤核受体的结合具有更好的稳定性。根据组合序列的不同，hres可分为三种形式:直接重复序列(drs,directrepeats)、外翻重复序列(ers,evertedrepeats)和内翻重复序列(irs,invertedrepeats)，其中drs是最常见的。由于drs中两半末端序列间的间距碱基数目差异,drs又有dr1、dr2、dr3、dr4和dr5五种。间距碱基的数目可影响孤核受体与dna结合时的空间构型,因此对孤核受体与dna结合力具有重要意义。
目前孤核受体活性调节剂的筛选主要依赖于双荧光素酶报告基因系统三质粒系统实现。实验操作中需要同时瞬时转染孤核受体过表达质粒、受孤核受体活性调控表达的萤火虫荧光素酶质粒pgl3-(dr1)3以及内参质粒prl-tk。此方法稳定性差，操作复杂，劳动强度大，不能适应大量药品的同时筛选。所以建立稳定、便捷的孤核受体活性调节剂的筛选方法具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用，本发明通过构建含受dr1的萤火虫荧光素酶以及内参海肾荧光素酶嵌合质粒(p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc)，即将如seqidno.1的片段插入到商品化质粒pmirglo经nhei/bglii双酶切后得到带有hrluc的骨架质粒中。通过将该质粒与孤核受体过表达质粒共转染细胞，利用双荧光素酶活力检测实现孤核受体活性调节剂的高效筛选。该方法操作简化，灵敏度高、专属性强。
本发明的双荧光素酶报告基因质粒的构建方法包括如下步骤实验：
1)将带有bglii和hindiii酶切位点序列的扩增mini-tk启动子引物，克隆到pgl3-basic质粒中，得到pgl3-tk质粒；所述的引物的正向序列如seqidno.2，反向序列如seqidno.3；
2)将带有nhei和bglii内切酶的(dr1)3片段克隆到pgl3-tk质粒中，得到pgl3-tk-(dr1)3质粒；所述的(dr1)3片段为由如seqidno.4的序列1和如seqidno.5的序列2形成的dna双链；
3)将pgl3-tk-(dr1)3质粒用nhei/bamhi双酶切，得到tk-(dr1)3片段；
4)将pmirglo质粒用nhei/bglii双酶切得到带有hrluc的骨架质粒；
5)将步骤3)得到的tk-(dr1)3片段和步骤4)中所得到的骨架质粒通过t4连接酶连接，得到双荧光素酶报告基因质粒p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc。
如上所述的双荧光素酶报告基因质粒可用于孤核受体活性调节剂的筛选。具体如下：
(1)用双荧光素酶报告基因质粒p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc与孤核受体过表达质粒共转染细胞；
(2)转染24-36小时后，加入待检测化合物，裂解细胞，检测细胞裂解液的萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性比值，与未加入化合物的对照组相比较，获得待检测化合物对孤核受体活性的调控效果。
本发明的有益效果是：
孤核受体活性调节剂对于孤核受体功能研究以及孤核受体相关疾病的治疗具有重要的意义。本发明首次将启动子区域插入孤核受体反应元件的萤火虫荧光素酶基因与海肾荧光素酶整合到一个质粒中，以萤火虫荧光素酶基因作为主报告基因考察小分子化合物对孤核受体活性的调节作用，以海肾荧光素酶作为对照报告基因用于归一化处理，克服了实验操作过程、转染效率和细胞状态差异等因素对结果的影响。将该质粒应用于孤核受体活性调节剂的筛选，具有操作简便、灵敏度高、专属性强等优点，可实现半自动化、高通量地对候选的小分子进行大规模的筛选。
附图说明
图1为本发明中p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc的质粒图谱；
图2为p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc质粒酶切结果；其中m为分子量标准，1为bamhi单酶切条带，预期分子量7257bp；2为bamhi/nhei双酶切条带，预期分子量分别为2822bp+4435bp；3为bglii/asei，预期分子量为3482bp+3775bp。
图3为睾丸孤核受体4(tr4)、9-cis-ra(tr4激动剂)、metformin(tr4抑制剂)及受试药物enzalutamide对p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc报告基因载体的调控作用示意图。其中，cos-7细胞转染tr4与p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc后，细胞裂解液中萤火虫荧光素酶活力/海肾荧光素酶活力比值显著升高；9-cis-ra添加组的细胞裂解液中萤火虫荧光素酶活力/海肾荧光素酶活力比值进一步升高；metformin添加组的细胞裂解液中萤火虫荧光素酶活力/海肾荧光素酶活力比值显著减低；受试药物enzalutamide添加组的细胞裂解液中萤火虫荧光素酶活力/海肾荧光素酶活力比值显著减低。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
一、菌株、质粒及试剂的准备。
菌株：大肠杆菌感受态细胞dh5a购自大连takara公司；
细胞系：cos-7细胞购自中科院上海细胞库；
质粒：pgl3-basic、prl-tk、pmirglo购自promega公司。
试剂来源：2×pcrtaqmix、t4dnaligase购自fermentas；无内毒素质粒小量提取试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、dna提取试剂盒购自康为世纪公司；限制性内切酶nhei、bglii、bamhi、hindiii购自neb公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自epigenetics公司；荧光素酶检测试剂盒购自promega公司；lipofectaminetm3000购自invitrogen公司；dmem培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、pbs缓冲液、opti-mem培养基、青链霉素购自杭州吉诺生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
二、质粒构建
(一)pgl3-tk质粒构建
1.设计合成带有bglii和hindiii酶切位点序列的扩增mini-tk启动子引物：
forward(seqidno.2),5’-tcgagatctcttcgcatattaaggtgac-3’
reverse(seqidno.3),5’-gccaagcttgcatgctgttgacgctgtt-3’。
50μlpcr反应体系加样参数：正反引物各1μl(10pm)，10mmdntp1μl，10×pcrbuffer5μl，lataq酶1μl，prl-tk质粒100ng，以超纯水补足至50μl。pcr运行参数：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸20秒，重复循环34次。
2.利用胶回收试剂盒(zymo,货号d4008)将pcr产物纯化回收，操作方法按照试剂说明书。
3.利用限制性内切酶bglii和hindiii双酶切纯化产物和pgl3-basic空载体质粒各1μg。酶切体系(50μl)：10×酶切缓冲液5μl，两种限制性内切酶各5μl，dna1μg，加超纯水补足至50μl。酶切温度37℃，酶切时间2小时。
4.回收上述酶切后的片段，进行连接反应。连接反应体系(20μl)：10×连接缓冲液2μl，载体骨架50ng，插入片段500ng，超纯水补足至20μl。16℃连接过夜。
5.连接产物转入大肠杆菌，并挑取单克隆进行测序，确定载体构建成功。利用高纯度质粒小提试剂盒(康为世纪，货号：cw0500s)提取质粒、测浓度，适当条件下保存待用。
(二)pgl3-tk-(dr1)3质粒构建
1.设计合成带有nhei和bglii内切酶的(dr1)3片段(序列1seqidno.4和序列2seqidno.5)：
5’-ctagcccgggctcgaggaagaggtcaaaggtcaagggttcgaggaagaggtcaaaggtcaagggttcgaggaagaggtcaaaggtcaagggttcga-3’，
5’-gatctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgagcccggg-3’，退火处理：200μmdna单链放入退火缓冲液(10mmtris,50mmnacl,1mmedta)，放置95度4分钟，然后置于冰上5-10分钟，保存在4度备用。
2.利用限制性内切酶nhei和bglii双酶切pgl3-tk质粒1μg，并回收酶切产物备用。操作同前。
3.将1和2中得到的片段进行连接，连接产物转化后挑取单克隆测序验证pgl3-tk-(dr1)3质粒构建是否成功。
(三)p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc质粒构建
1.利用限制性内切酶bglii和nhei双酶切pmirglo空载体质粒1μg，切胶回收含hrluc的片段(5120bp)，备用。
2.利用限制性内切酶bamhi和nhei双酶切pgl3-tk-(dr1)3质粒1μg，切胶回收含tk-(dr1)3-fluc的片段(2134bp)，备用。
3.将上述片段进行连接反应，连接产物转入大肠杆菌，并挑取单克隆进行测序，确定载体构建成功。提取质粒、测浓度，适当条件下保存待用。
三、孤核受体活性调节剂筛选
1.提前1天于96孔板中培养cos-7细胞(dmem培养基+10％fbs(体积分数))，待细胞长至覆盖70％作用的面积(约24小时)进行质粒转染。
2.96孔板的每孔转染体系中(100μl)含p-tk-(dr1)3-fluc-hrluc报告质粒0.1μg和pcdna3.1-vector/tr4质粒0.1μg；转染试剂采用lipofectamine3000(invitrogen,货号：l3000015)，转染方法按照试剂说明书。
3.转染24小时后，在不同的实验组中加入适量的9-cis-ra(tr4激动剂)、metformin(tr4抑制剂)或待选小分子化合物孵育24小时。
4.裂解细胞并检测荧光素酶活性。细胞裂解和荧光素酶活性检测采用dual-luciferasereporterassaysystem(promega,货号：e2920)，使用方法按照试剂说明书。
5.通过荧光素酶活性检测发现tr4过表达组与vector组相比萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的活性比值显著升高(约15倍)；9-cis-ra(20μm)组的萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的活性比值在tr4过表达组的基础上进一步提高，约1.8倍；metformin(500μm)组的萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的活性比值在tr4过表达组的基础上受到显著的抑制，抑制约30％；受试化合物雄激素受体拮抗剂enzalutamide(20μm)组萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的活性比值比tr4过表达组低(见图3)。由此可见，本发明的方法能够根据所检测到的活性比值对孤核受体tr4活性调节剂进行有效地、特异性地筛选。
表1.质粒转染及调节剂孵育实验安排
“×3”指每组做3个平行。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种可用于孤核受体活性调节剂筛选的双荧光素酶报告基因质粒及其构建与应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2137
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cttatcgattttaccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctc60
cccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagct120
tataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttca180
ctgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgctcgaag240
cggccggccgccccgactctagaattattacacggcgatcttgccgcccttcttggcctt300
aatgagaatctcgcggatcttgcgggcgtccaacttgccggtcagtcctttaggcacctc360
gtccacgaacacaacaccaccgcgcagcttcttggcggttgtaacctggctggccacata420
gtccacgatctccttctcggtcatggttttaccgtgttccagcacgacgactgcggcggg480
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gctcttcagccggtccacgatgaagaagtgctcgtcctcgtcccagtaggcgatgtcgcc660
gctgtgcagccagccgtccttgtcgatgagagcgtttgtagcctcggggttgttaacgta720
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cttaccggtgtccaagtccaccaccttagcctcgaagaagggcaccaccttgcctactgc840
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atagtcttgcaagctgcgcaagaatagctcctcctcgaagcggtacatgagcacgacccg1140
aaagccgcagatcaagtagcccagcgtggtgaacatgccgaagccgtggtgaaatggcac1200
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actgaatcggacacaagcggtgcggtgcggtagggctacgcccttgggcaatccggtact1320
gccactactgttcatgatcagggcgatggttttgtcccggtcgaagctctcgggcacgaa1380
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cccgtcttcgagtgggtagaatggcgctgggcccttcttaatgtttttggcatcttccat1920
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gtcgctgcagggtcgctcggtgttcgaggccacacgcgtcaccttaatatgcgaagagat2040
ctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgaa2100
cccttgacctttgacctcttcctcgagcccgggctag2137
<210>2
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcgagatctcttcgcatattaaggtgac28
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gccaagcttgcatgctgttgacgctgtt28
<210>4
<211>96
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctagcccgggctcgaggaagaggtcaaaggtcaagggttcgaggaagaggtcaaaggtca60
agggttcgaggaagaggtcaaaggtcaagggttcga96
<210>5
<211>96
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gatctcgaacccttgacctttgacctcttcctcgaacccttgacctttgacctcttcctc60
gaacccttgacctttgacctcttcctcgagcccggg96