本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重pcr检测方法本发明涉及检测猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型的引物。
背景技术：
猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)是目前发现的最小的动物病毒，为环状单链dna病毒，能在哺乳动物细胞中自主复制。pcv包括pcv1和pcv2两个基因型[2]。pcv1是pk15细胞培养过程中发现的病毒，研究认为对猪无致病性。pcv2基因组由1,767-1,768个核苷酸组成，预测有11个开放阅读框(orf)。基因间隔区(intergenicregion，ir)含病毒的复制起点(sl)茎环结构。基因组包含2个主要的orf，orf1和orf2分别编码复制酶(rep)和衣壳蛋白(cap)。capn端143-145aa(nys)位置存在一个糖基化位点。rep包含三个潜在的糖基化位点，分别在第23-25aa(nps)、第256-258aa(nqt)和第286-288aa(nat)。临床方面，pcv2主要感染家猪和野猪，大多数在4-11周龄时感染。临床常见的pmws表现包括仔猪消瘦、呼吸困难和淋巴结明显肿大。pdns特征为红色到紫色的不规则斑块和皮肤丘疹、皮下出血和水肿、以浅表腹股沟为主的淋巴结肿大、双侧肾脏扩大、小皮质瘀斑和肾盂水肿等。
pcv3是pcv的一种新基因型，2016年首次报道pcv3与心肌炎和肾小球肾炎有关，研究发现在pdns症状母猪及其流产胎儿体内检出唯一病原体为pcv3。2017年湖北、广东、安徽等省市陆续检测到pcv3感染猪群的现象。pcv3为单股无囊膜dna，基因组大小2000bp，包含2个主要开放阅读框(orf)，其中，orf1和orf2分别编码由297个氨基酸组成复制酶蛋白rep，和214个氨基酸组成衣壳蛋白cap。pcv2与pcv3cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，同时在研究中发现，二者混合感染率为42.9％。由于pcv3在我国是新发现的疫病，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对猪群的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对当前猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型检测技术手段的缺乏，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重pcr检测方法及检测用引物。该检测方法的检测灵敏度分别达到可达508copies/μl和412copies/μl，对于单个样本检测时间为1.5个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。
在本发明的一方面，提供一种猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重pcr检测方法，其特征包括：
(1)针对猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型设计能够检测同时检测毒的特异性引物；
(2)将用于检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物置于同一反应管中，使用pcr扩增仪进行pcr反应
在本发明提供一种用于同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的引物，其序列为：
pcv3f：ttacttagagaacggacttgtaacg
pcv3r：aaatgagacacagagctatattcag
pcv2f：tttcagcgatgacgtatccaaggag
pcv2r：tagtattcaaagggcacagtgaggg
在本发明的另一方面，提供检测鸭痘病毒的实时荧光pcr检测的反应程序，具体为：98℃预变性5min，35个循环变性；98℃10s，58℃20s，72℃20s；72℃5min。
本发明采用pcr进行猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的特异性检测，具有以下优点：
(1)特异性好，用该二重pcr反应体系，以pcv3和pcv2阳性模板均能扩增出649bp和295bp的特异性条带，而以其他常见猪病毒核酸为模板时均未扩增出特异性条带；
(2)灵敏度高，荧光检测技术是极灵敏的检测技术，本方法的检测灵敏度可达508copies/μl和412copies/μl；
(3)操作简便，自动化程度高，扩增和检测短时间完成。
附图说明
图1为本发明实施例1pcv3和pcv2二重pcr退火温度优化结果。1-6：退火温度60℃，59℃，58℃，57℃，56℃。
图2为本发明实施例2pcv3和pcv2二重pcr检测方法的特异性试验试验结果。1.pcv2；2.pcv3；3.pcv3+pcv2；4～7：分别是prrsv，jev，prv，fmdv；8：阴性对照。
图3为本发明实施例3pcv3和pcv2的双重pcr检测方法的敏感性试验结果。1：5.08×1010copies/μlpcv3+4.12×1010copies/μlpcv2；2：5.08×109copies/μlpcv3+4.12×109copies/μlpcv2；3：5.08×108copies/μlpcv3+4.12×108copies/μlpcv2；4：5.08×107copies/μlpcv3+4.12×107copies/μlpcv2；5：5.08×106copies/μlpcv3+4.12×106copies/μlpcv2；6：5.08×105copies/μlpcv3+4.12×105copies/μlpcv2；7：5.08×104copies/μlpcv3+4.12×104copies/μlpcv2；8：5.08×103copies/μlpcv3+4.12×103copies/μlpcv2；9：5.08×102copies/μlpcv3+4.12×102copies/μlpcv2；10：阴性对照
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。
实施例1：
pcv3和pcv2二重pcr退火温度优化结果
1、针对pcv3和pcv2基因设计能够检测pcv3和pcv2的特异性引物：
pcv3f：ttacttagagaacggacttgtaacg
pcv3r：aaatgagacacagagctatattcag
pcv2f：tttcagcgatgacgtatccaaggag
pcv2r：tagtattcaaagggcacagtgaggg
上下游引物均由吉林库美生物公司合成。
2、提取病毒dna
取pcv3猪组织阳性病料组织样品，加无菌生理盐水研磨成组织悬液，pcv2nm株基因组提取用takaraminibestviraldna/rnaextractionkit(大连宝生物公司)提取样品dna。
3、pcr检测
通过对反应体系及反应条件的优化，最终确定二重pcr体系。每个反应总体积为25μl：1μldna，20μl金牌mix，1μl每种引物(pcv3-f/pcv3-r，pcv2-f/pcv2-r)(10μm)：反应条件为：98℃预变性5min，35个循环变性；98℃10s，58℃20s，72℃20s；72℃5min。
4、试验结果
1-6：退火温度60℃，59℃，58℃，57℃，56℃。表明实时荧光pcr检测结果与预期相符，表明设计的引物能特异性检测pcv3和pcv2。
实施例2：
pcv3和pcv2二重pcr检测方法的特异性试验
1、实验所用的病毒和样品
pcv3组织样品采集，由广西动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。pcv2nm株由军事兽医研究所提供。
其他猪源病毒：猪繁殖与呼吸综合症病毒(procinereproductiveandrespiratorsyndrome，prrs)、乙脑病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)、伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)、口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus，fmdv)均由军事兽医研究所保存。
2、病毒核酸提取
将pcv3组织样品研磨成组织悬液。然后用takaraminibestviraldna/rnaextractionkit(大连宝生物公司)分别提取组织悬液、病毒培养物或者疫苗等样品中的病毒核酸。
3、pcr检测方法的特异性试验
采用实施例1中所提供的pcr检测方法分别对提取的核酸样品进行检测，以确定方法的特异性。
4、试验结果
特异性试验结果显示，运用该二重pcr反应体系，以pcv3和pcv2阳性模板均能扩增出649bp和295bp的特异性条带，而以其他常见猪病毒核酸为模板时均未扩增出特异性条带。
实施例3
pcv3和pcv2二重pcr检测方法的灵敏性试验
1、实验所需样品
以构建的阳性质粒为模板，计算pcv3和pcv2质粒拷贝数分别为5.08×1010copies/μl和4.12×1010copies/μl，将两个阳性模板质粒分别进行10倍梯度稀释，采用所建立的双重pcr方法分别进行扩增。2、实时荧光pcr检测方法的灵敏性试验
以稀释好的梯度质粒作为样品，采用实施例1中所提供的荧光pcr检测方法进行检测，以确定方法的灵敏性。
3、试验结果
该方法对pcv3和pcv2的最低检测浓度分别为508copies/μl和412copies/μl(图3)。
附件1：
附件2：