本发明属于生物酶载体技术领域，尤其属于二氧化硅(sio2)纳米片的制备技术领域。
背景技术：
随着对绿色化学和可持续发展越来越多的关注和需求，在各种化学反应中加入酶的应用越来越多。生物酶不仅在人体的多种功能发挥着重要作用，它作为绿色催化剂在化学工业有也是至关重要的。这些高选择性的生物催化剂可以在温和的条件下工作并且没有废物产生。但是，在反应过程中维持其稳定性始终是限制酶应用的最大难题之一。
将酶固定在载体中可以提高其催化稳定性以及可操作性。此外，还可以实现从反应过程中将酶回收并重复使用。相关领域科学家已经研发了各种载体来固定酶，如二氧化硅、聚合物、碳和金属有机骨架等。具有大表面积，可控孔径，高稳定性和生物相容性的介孔二氧化硅是酶固定化最有应用潜力的载体，而且可以用各种官能团进行修饰，以满足固定化酶的具体要求。然而，大多数介孔载体的孔径小于10nm，结构上会对酶的承载产生限制作用而不能包封尺寸较大的酶。有限的孔隙空间可能会降低或阻碍催化反应过程中酶的流动性和底物的进入，这意味着酶的催化效率降低。如果增大孔径，虽然酶的负载量会增加，但其在孔内通道内的解吸也同样会变显著，没有表面的相互作用，酶在大孔径结构内的固定仍存在一定问题。因此，制备新的介孔二氧化硅来增强酶固定和保持酶活性仍然是一个挑战。
技术实现要素：
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种具有多尺寸孔隙的二氧化硅纳米片负载酶成为催化剂的制备方法。
技术方案：本发明提供的具有多尺寸孔隙的二氧化硅纳米片负载酶成为催化剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将0.05-0.3g直径为400-500nm的sio2无定形纳米球浸入20-50ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3-15ml)中，并在75-120℃下孵育6-30小时同时以200-500r/min的速率搅拌；
步骤2：将上述反应后得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤3：漂洗上述得到的样品，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片；
步骤4：用浓度均为0.1m的tris溶液和hcl溶液配置ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液待用；
步骤5：取部分步骤4配制的缓冲液，向其中加入酶，配制酶浓度为0.4-1mg/ml的酶溶液；
步骤6：取1-3mg步骤3中得到的sio2纳米片加入3-9ml步骤5中得到的酶溶液中；
步骤7：将上述溶液置于冰水浴中旋转混合24小时，再通过离心收集底层混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并将其分散在步骤4中配制的tris-hcl缓冲液中。
作为一种优化方案：步骤5中加入缓冲液中的酶为adh。
作为进一步优化方案：步骤5中加入缓冲液中的酶为hrp。
有益效果：本发明提供的多尺寸孔隙的二氧化硅纳米片作为酶载体，使得酶可以以较高的负载率固定在sio2纳米片上，使其催化强度到了增强。
附图说明
图1为本发明二氧化硅纳米片负载酶成为催化剂的流程示意图；
图2为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片扫描透射电子显微图；
图3为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片扫描透射电子显微图；
图4为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片透射电子显微图；
图5为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片透射电子显微图；
图6为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片高倍透射电子显微图；
图7为本发明未负载酶的二氧化硅纳米片bet比表面积分析图及孔径分布图；
图8为本发明催化实验与对比实验的反应结果在340nm紫外可见光照射下所得数据示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.06g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3ml)中，并在100℃下孵育24小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例2
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.2g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入50ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，10ml)中，并在100℃下孵育24小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例3
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.25g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入50ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，13ml)中，并在100℃下孵育24小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例4
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.06g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3ml)中，并在75℃下孵育24小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例5
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.06g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3ml)中，并在100℃下孵育16小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例6
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.06g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3ml)中，并在100℃下孵育24小时，同时以250r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例7
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.06g直径为450nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，3ml)中，并在100℃下孵育24小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.5mghrp加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.5mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将1mgsio2纳米片加入3mlhrp酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例8
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.05g直径为400nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，15ml)中，并在120℃下孵育6小时，同时以500r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将3.0mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml1mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将2mgsio2纳米片加入6mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实施例9
步骤1：制备sio2纳米片。具体包括如下步骤：
步骤1.1：将0.3g直径为500nm的sio2无定形纳米球浸入20ml容量的聚四氟乙烯衬里的钢高压釜中的nabh4溶液(0.10g/ml，10ml)中，并在100℃下孵育30小时，同时以200r/min的速率搅拌；
步骤1.2：将反应后的得到的溶液离心，收集溶液中的sio2纳米片；
步骤1.3：将得到的样品进行漂洗，并在室温下真空干燥，得到sio2纳米片。
步骤2：制备酶溶液。具体包括如下步骤：
步骤2.1：配置0.1m的tris溶液；
步骤2.2：配置0.1m的hcl溶液；
步骤2.3；50mltris溶液、-17.2mlhcl溶液混合得到ph＝8.4的50mm的tris-hcl缓冲液；
步骤2.4：将1.2mgadh加入3ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到3ml0.4mg/ml的酶溶液。
步骤3：负载酶到sio2纳米片催剂。具体包括如下步骤：
步骤3.1：将3mgsio2纳米片加入9mladh酶溶液中；
步骤3.2：在冰水浴中旋转混合24小时，然后通过离心收集混合物，得到承载酶的sio2纳米片催化剂，并再分散在tris-hcl缓冲液中。
实验结果：
9个实施例均得到如图2-6所示的sio2纳米片，且比表面积和孔径分布如图7所示，比表面积为575m2.g-1，孔径分布在3-20nm。
下面通过实验，对比测定实施例1中所得到的承载adh的sio2纳米片催化剂和adh粉末的催化效果，具体实验内容为通过对酒精的催化氧化评价其催化性能。
催化实验1
步骤1：将2.5mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)加入50ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到0.05mg/ml的辅酶溶液；
步骤2：将100μl56％乙醇溶液加入到3ml0.05mg/ml的辅酶溶液中混合；
步骤3：加入1mg实施例1得到的负载adh的sio2纳米片，开始催化反应。
对比实验1：将上述催化实验1中的负载adh的sio2纳米片改为adh粉末，其他步骤保持一致。
催化实验2
步骤1：将2.5mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)加入50ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到0.05mg/ml的辅酶溶液；
步骤2：将100μl二锅头白酒(酒精度56％)加入到3ml0.05mg/ml的辅酶溶液中混合；
步骤3：加入1mg实施例1得到的负载adh的sio2纳米片，开始催化反应。
对比实验2：将上述催化实验2中负载adh的sio2纳米片改为adh粉末，其他步骤保持一致。
催化实验3
步骤1：将2.5mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)加入50ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到0.05mg/ml的辅酶溶液；
步骤2：将100μl12％乙醇溶液加入到3ml0.05mg/ml的辅酶溶液中混合；
步骤3：加入1mg实施例1得到的负载adh的sio2纳米片，开始催化反应。
对比实验3：将上述催化实验3中负载adh的sio2纳米片改为adh粉末，其他步骤保持一致。
催化实验4
步骤1：将2.5mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)加入50ml50mm的tris-hcl缓冲液中，得到0.05mg/ml的辅酶溶液；
步骤2：将100μl张裕干红(酒精度12％)加入到3ml0.05mg/ml的辅酶溶液中混合；
步骤3：加入1mg实施例1得到的负载adh的sio2纳米片，开始催化反应。
对比实验4：将上述催化实验4中负载adh的sio2纳米片改为adh粉末，其他步骤保持一致。
所有的催化实验和相应的对比实验进行的反应，都在反应结束之后将反应产物溶液快速进行了uv-vis测量，结果如图8所示。
因此，本发明提出一种新的具有多尺寸孔隙的sio2纳米片作为酶载体，使得乙醇脱氢酶(adh)、辣根过氧化酶(hrp)等大尺寸酶也可以以较高(30％)的负载率固定在sio2纳米片上，且其催化强度由于催化活性位点通过孔隙暴露在外而得到了增强。本发明得到的催化剂不仅在纯乙醇溶液中可以发挥作用，在成分复杂的红酒环境中其催化活性也没有降低。而且后续实验得出，在重复使用5次之后，催化活性还能保持96％。由此推测，本发明在未来酒精度检测以及解酒药等方面都存在很广阔的应用前景。