本发明涉及具有jak激酶抑制作用的杂环化合物，用作预防预防、治疗和/或改善自身免疫疾病(例如，牛皮癣(psoriasis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、炎性肠炎疾病(inflammatoryenteritisdisease)、斯耶格伦氏综合征(sjogren′ssyndrome)、白塞氏病(behcet′sdisease)、多发性硬化(multiplesclerosis)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus)等等)等等的药物，还涉及含有它的药物组合等等。
背景技术：
：
jak激酶(januskinase)和其下游的效应器、信号转导及转录激活蛋白(signaltransducersandactivatorsoftranscriptionproteins，stats)形成了重要的细胞因子信号传导途径——jak-stat通路(science，1994，264：1415-1421)。该通路的发现，大大提高了研究者对基因调控的认识，研究发现jak-stat通路可由多种细胞因子、生长因子以及受体激活，参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫调节等过程(worldjgastroenterol，2007，13：6478-6491)。
jak激酶家族在细胞素依赖性调节与生长和免疫应答相关的细胞的功能方面起一定作用。在哺乳动物体内，有四种jak激酶：jak-1(亦称为janus激酶1)、jak-2(亦称为janus激酶2)、jak-3(亦称为janus激酶3)和tyk-2(亦称为tyrosine激酶2)。jak-stat信号通路是一条由多种细胞因子受体刺激的信号转导通路，jak激酶介导细胞内大多数细胞因子的信号传导(progmedchem，2013，52：153-223)，如白介素(il)类、干扰素(ifn)类、促红细胞生成素(epo)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)、促生长素(gh)、催乳素(prl)、促血小板生成素(tpo)、血小板衍生因子(pdgf)以及表皮细胞生长因子(egf)等，而且不同受体可激活不同亚型的jak激酶，从而表现差异化的生物学功能(immunolrev，2008，223：132-142，natimmunol，2009，10：356-360)。其中，jak-3通过与il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21等i型细胞因子受体复合物中的γ链(γc)相结合，调节细胞信号传导。当jak-3缺陷或γc突变时，可导致重症联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency，scid)(blood，1996，88：817-823)，表现为t细胞和自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)细胞减少、b细胞功能丧失等免疫限制的症状(chinjnewdrug，2015，24：39-45)。当存在合适数量的这些细胞素时，这些细胞素在免疫应答中起重要作用。然而，人们认为，它们的过度产生与许多自身免疫疾病有关，例如牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等等(journalofallergyandclinicaltmmurmlogy127，3，701-721.e70(2011)，cytokine&growthfactorreviews19，41-52(2008)，investophthalmolvissci.2008jul；49(7)：3058-3064，annrheumdis.2010jul；69(7)：1325-1328)。例如，在欧洲，ustekinumab，其是抗il-12/23单克隆抗体，已经批准它作为中度至严重牛皮癣患者的治疗药物，此外，还进行了il-12/23信号途径所涉及的各种疾病的临床试验。由上述可知，jak激酶抑制剂是各种自身免疫疾病的潜在治疗药物(frontbiosci.2011jun1；17：3214-32)。
与本说明书所描述化合物的结构相似的化合物的例子包括下列化合物。
(1)下式代表的化合物：
(非专利文献1)。
(2)下式代表的化合物：
(非专利文献2)。
(3)下式代表的化合物：
(非专利文献3)。
(4)在化学文摘中，登记了下列化合物。
1)登记号：1808289-89-5
2)登记号：1422827-35-7
文献列表
非专利文献
[非专利文献1]zapfcw，gerstenbergerbs，xingl，etal.covalentinhibitorsofinterleukin-2inducibletcellkinase(itk)withnanomolarpotencyinawhole-bloodassay[j].journalofmedicinalchemistry，2012，55(22)：10047-10063.
[非专利文献2]lix，wanga，yuk，etal.discoveryof(r)-1-(3-(4-amino-3-(4-phenoxypheny1)-1h-pyrazolo[3，4-d]pyrimidin-1-y1)piperidin-1-y1)-2-(dimethylamino)ethanone(chmfl-flt3-122)asapotentandorallyavailableflt3kinaseinhibitorforflt3-itdpositiveacutemyeloidleukemia[j].journalofmedicinalchemistry，2015，58(24)：9625-9638.
[非专利文献3]engelj，beckerc，lategahnj，etal.insightintotheinhibitionofdrug-resistantmutantsofthereceptortyrosinekinaseegfr[j].angewandtechemieinternationaledition，2016，55(36)：10909-10912.
本发明概述
本发明解决的问题
本发明的一个目标是，提供具有优良的jak-1和/或jak-3抑制作用的预防、治疗和/或改善自身免疫疾病(例如，牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等等)等等的药物。
解决问题的方法
为了尝试解决上述问题，本发明人进行了深入的研究，并且发现，下式所代表的化合物(i)具有优良的jak-1和/或jak-3抑制作用，从而完成本发明。
相应地，本发明提供了下列内容。
[1]式(i)代表的化合物或其盐：
其中
x1是氮原子或-ch-；
x2是氮原子或-ch-；
r1是氢原子、卤素原子、氰基、丙烯酰基、2-氰基乙酰基、任选取代的c1-6烃基或任选取代的环状基团；
r2是氢原子、卤素原子、氰基、任选取代的c1-6烷基；
r3、r4独立地选自氢原子、卤素原子、氰基、任选取代的c1-6烃基或任选取代的环状基团；r5是l1-a-l2-g，其中，
l1是任选的，并且当存在时是键、任选地被取代的或未被取代的c1-6烃基、任选地被取代的或未被取代的c3-8环烃基、任选地被取代的或未被取代的c2-7烯基、任选地被取代的或未被取代的c2-7炔基；
a是任选的，并且当存在时是键、-o-、-c(＝o)-、-s-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-nh-、-nr10-、-nhc(o)-、-c(o)nh-、-nr10c(o)-、-c(o)nr10-、-s(＝o)2nh-、-nhs(＝o)2-、-s(＝o)2nr10-、-nr10s(＝o)2-、-oc(o)nh-、-nhc(o)o-、-oc(o)nr10-、-nr10c(o)o-、-ch＝no-、-on＝ch-、-nr11c(o)nr11-、杂芳基-、芳基-、-nr11c(＝nr12)nr11-、-nr11c(＝nr12)-、-c(＝nr12)nr11-、oc(＝nr12)-或-c(＝nr12)o-；
l2是任选的，并且当存在时是键、任选地被取代的或未被取代的c1-6烃基、任选地被取代的或未被取代的c3-8环烃基、任选地被取代的或未被取代的c2-7烯基、任选地被取代的或未被取代的c2-7炔基、被取代的或未被取代的5-、6-、7-或8-元芳基、被取代的或未被取代的5-、6-、7-或8-元杂芳基、被取代的或未被取代的4-、5-、6-、7-或8-元杂环；
或l1、a和l2一起形成包含氮的杂环；
g独立地选自氢原子、卤素、氰基、羟基、
其中，
b独立地选自氢原子、卤素、氰基、羟基；
r6、r7、r8和r9独立地选自氢原子、卤素、氰基、羟基、被取代的或未被取代的c1-6烃基或被取代的或未被取代的c1-6杂烃基或被取代的或未被取代的c3-8环烃基、被取代的或未被取代的c3-8杂环烃基、被取代的或未被取代的5-、6-、7-或8-元芳基、被取代的或未被取代的5-、6-、7-或8-元杂芳基；
每个r10独立地选自氢原子、被取代的或未被取代的c1-6烃基，以及被取代的或未被取代的c3-8环烃基；
每个r11独立地为氢原子、被取代的或未被取代的c1-6烃基，或被取代的或未被取代的c3-8环烃基；或者两个r11基团可以一起形成5-、6-、7-或8-元杂环；或者
r11和r12可以一起形成5-、6-、7-或8-元杂环；或者
每个r12独立地选自氢原子或被取代的或未被取代的c1-6烃基；
[2]上述[1]的化合物或其盐，其中，
r1是
(1)氢原子，
(2)卤素原子，
(3)氰基，
(4)丙烯酰基，
(5)2-氰基乙酰基，
(6)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c1-6烷基：(a)氢原子，(b)卤素原子，(c)羟基，(d)c1-6烷氧基，(e)c3-8环烷基，(f)c1-6烷基-羰基单或二取代的氨基，
(7)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c2-7烯基：(a)氢原子，(b)卤素原子，(c)任选取代的c1-6烷基，
(8)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c2-7炔基：(a)氢原子，(b)卤素原子，(c)任选取代的c1-6烷基，
(9)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c3-10环烷基：(a)卤素原子，(b)c1-6烷基；
(10)3至8元单环非芳香杂环基团，或
(11)任选被1至3个选自下列的取代基取代的5或6元单环芳香杂环基团：(a)卤素原子，(b)氰基；r2是氢原子、卤素原子或氰基；
r3、r4独立地选自
(1)氢原子，
(2)卤素原子，
(3)氰基，
(4)丙烯酰基，
(5)2-氰基乙酰基，
(6)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c1-6烷基：(a)氢原子，(b)卤素原子，(c)羟基，(d)c1-6烷氧基，(e)c3-8环烷基，(f)c1-6烷基-羰基单或二取代的氨基，
(7)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c2-6烯基：(a)氢原子，(b)卤素原子，(c)任选取代的c1-6烷基，
(8)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c3-10环烷基：(a)卤素原子，(b)c1-6烷基，
(9)任选被1至3个选自下列的取代基取代的c6-14芳基：(a)卤素原子，(b)任选被1至3个卤素原子取代的c1-6烷基，(c)氰基，(d)任选被c1-6烷基-羰基单或二取代的氨基，(e)c1-6烷氧基，
(10)3至8元单环非芳香杂环基团，或
(11)任选被1至3个选自下列的取代基取代的5或6元单环芳香杂环基团：(a)卤素原子，(b)氰基；r5是
[3]上述[1]至[2]中任一项所述的用途，其中l1、a和l2一起形成包含氮的杂环。
[4]上述[3]所述的用途，其中所述包含氮的杂环是氮杂环丁烷基团、吡咯烷基团或哌啶基团。
[5]上述[1]至[4]中任一项所述的用途，其中g是氰基、
[6]权利要求1-5中所述药物，其是jak-1和/或jak-3抑制剂。
[7]权利要求6中所述药物，其是预防、治疗和/或改善自身免疫疾病的药物。
[8]权利要求7中所述药物，其中自身免疫疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠炎疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化或系统性红斑狼疮。
[9]权利要求1的化合物或其盐用于制备药物的用途，该药物用于预防和/或改善自身免疫疾病。
[10]权利要求9的用途，其中自身免疫疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化或系统性红斑狼疮。
本发明效果
化合物(i)具有优良的jak-1和/或jak-3抑制作用，其用作预防、治疗或改善自身免疫疾病(例如，牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎等等)、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等等)的药物，等等。
本发明的详细说明
在本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
在本说明书中，“c1-6烃基(基团)”是指，c1-6烷基，c2-7烯基，c1-6烷氧基，c2-6烯氧基，c1-6烷基-羰基单或二取代的氨基芳基，等等。
在本说明书中，“c1-6烷基(基团)”是指，例如、甲基、乙基、异丙基、丁基、仲丁基、戊基、异戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、异己基、1，1-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、1，2-二甲丙基，等等。
在本说明书中，“c2-7烯基(基团)”是指，例如，乙烯基、1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、3-己烯基、5-己烯基，等等。
在本说明书中，“c2-7炔基(基团)”是指，例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、1，1-二甲基丙-2-炔-1-基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基，等等。
在本说明书中，“c1-6烷氧基(基团)”是指，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基，等等。
在本说明书中，“c2-6烯氧基(基团)”是指，例如，乙烯氧基、1-丙烯氧基、2-丙烯氧基、2-甲基-1-丙烯氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、4-甲基-3-戊烯氧基、1-己烯氧基、3-己烯氧基、5-己烯氧基，等等。
在本说明书中，“c1-6烷基-羰基单或二取代的氨基芳基(基团)”是指，例如，n，n-二甲基甲酰基，n，n-二甲基乙酰基，等等。
在本说明书中，“c6-14芳基(基团)”是指，例如，苯基、1-萘基、2-萘基，等等。
在本说明书中中，“单环芳香杂环基团”的例子包括5至7元(优选5或6元)单环芳香杂环基团，作为环构成原子，除了碳原子以外，其还含有1至4个选自氧原子、硫原子(任选氧化)和氮原子(任选氧化)的杂原子，例如，呋喃基(例如，2-呋喃基、3-呋喃基)等等
在本说明书中，“非芳香杂环基团”是指单环非芳香杂环基团和稠合的非芳香杂环基团。
在本说明书中中，“单环非芳香杂环基团”的例子包括3至8元(优选5或6元)单环非芳香杂环基团，作为环构成原子，除了碳原子以外，其还含有1至4个选自氧原子、硫原子(任选氧化)等等。
在本说明书中，“稠合的非芳香杂环基团”的例子包括8至22元稠合的非芳香杂环基团，具体地说，衍生自稠环的基团，其中，相当于上述3至8元单环非芳香杂环基团的环与c6-14芳香烃稠合；衍生自稠环的基团，等等。
当化合物(i)是盐形式时，其实例包括：金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或酸性氨基酸形成的盐，等等。
它们当中，优选药用盐。例如，当化合物具有酸性官能团时，其实例包括无机盐，例如，碱金属盐(例如，钠盐、钾盐等等)、碱土金属盐(例如，钙盐、镁盐等等)等等、铵盐等等，当化合物具有碱性官能团时，其实例包括与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢溴酸，等等，以及与有机酸形成的盐，例如乙酸、苯二酸、富马酸、草酸、对甲苯磺酸，等等。
制备方法
下面说明本发明的化合物(i)或其盐的制备方法。
化合物(i)和原料化合物可以按照本身已知的方法制备，例如，下列反应路线中所示的方法，等等。在下列制备方法的每个步骤中，“室温”通常是指5-40℃，除非另作说明，反应路线中所描述的化学式中的每个符号如上所述。在化学式的化合物中，每个化合物包括盐，这种盐的例子包括与化合物(i)的盐相似的盐，等等。
在化合物(i)中，式(i-a)所代表的化合物
其中，化学式中的每个符号如上所述，
(在下文中，简写为化合物(i-a))可以按照下列方法a、方法b、方法c或与其类似的方法制备。在制备方法的每个步骤中，原料化合物可以是盐形式。盐的例子包括与化合物(i)的盐相似的那些盐。
方法a
其中，y是卤素原子，z是-b(oh)2或-b(or)(or’)，其中r和r’各自独立地是c1-6烷基；或相邻的r和r’任选结合，例如，形成4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基，其它符号如上所述。
在该方法中，用作起始原料的化合物(ii)和化合物(ix)可以是商购的产品，或还可以按照本身已知的方法或与其类似的方法制备。
步骤a-1
该步骤是化合物(ii)与肼进行反应、使化合物(ii)转化为化合物(iii)的步骤。
每1mol化合物(ii)，肼的使用数量为大约1mol-大约100mol，优选大约1mol-大约10mol。
所使用的肼的例子包括：水合肼(浓度为5％-95％)、肼等等，它们当中优选60％水合肼、80％水合肼和85％水合肼。
在该步骤中，对溶剂没有特别限制，可用溶剂也可不用溶剂，只要反应能够进行即可。
在该步骤中，反应温度通常为大约-50℃-大约200℃，优选大约-10℃-大约100℃。在该步骤中，反应时间通常为大约0.1小时-大约100小时。
可以利用已知的分离和纯化方法，例如，浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、重结晶、相转移、色谱等等，将由此所获得的化合物(iii)分离和纯化。此外，化合物(iii)不用纯化就可以直接用于下一个反应。
步骤a-2
该步骤是化合物(iii)与酰胺进行反应、使化合物(iii)转化为化合物(iv)的步骤。
每1mol化合物(iii)，酰胺的使用数量为大约1mol-大约100mol，优选大约1mol-大约30mol。
所使用的酰胺的例子包括：甲酰胺、乙酰胺等等，它们当中优选甲酰胺。
在该步骤中，对溶剂没有特别限制，可用溶剂也可不用溶剂，只要反应能够进行即可。
在该步骤中，反应温度通常为大约-50℃-大约250℃，优选大约50℃-大约250℃。在该步骤中，反应时间通常为大约0.1小时-大约100小时。
可以利用已知的分离和纯化方法，例如，浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、重结晶、相转移、色谱等等，将由此所获得的化合物(iv)分离和纯化。此外，化合物(iv)不用纯化就可以直接用于下一个反应。
步骤a-3
该步骤是化合物(iv)与卤代试剂进行卤代反应、使化合物(iv)转化为化合物(v)的步骤。
每1mol化合物(iv)，卤代试剂的使用数量为大约1mol-大约100mol，优选大约1mol-大约10mol。
所使用的卤代试剂的例子包括：氟、氯、溴、碘、nbs、nis等等，它们当中优选溴、碘。
在该步骤中，对溶剂没有特别限制，只要反应能够进行即可。
在该步骤中，反应温度通常为大约-50℃-大约200℃，优选大约50℃-大约200℃。在该步骤中，反应时间通常为大约0.1小时-大约100小时。
在该步骤中，反应气体保护没有特别限制，可进行气体保护也可不保护，只要反应能够进行即可。保护气体包括：氮气、氩气等。
可以利用已知的分离和纯化方法，例如，浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、重结晶、相转移、色谱、酸溶碱沉等等，将由此所获得的化合物(v)分离和纯化。此外，化合物(v)不用分离就可以直接用于下一个反应。
步骤a-4
该步骤是化合物(v)与取代试剂进行取代反应、使化合物(v)转化为化合物(vi)的步骤。
每1mol化合物(vi)，取代试剂的使用数量为大约1mol-大约100mol，优选大约1mol-大约10mol。
在该步骤中，对溶剂没有特别限制，只要反应能够进行即可。
在该步骤中，反应温度通常为大约-50℃-大约250℃。在该步骤中，反应时间通常为大约0.1小时-大约100小时。
在该步骤中，反应气体保护没有特别限制，可进行气体保护也可不保护，只要反应能够进行即可。保护气体包括：氮气、氩气等。
可以利用已知的分离和纯化方法，例如，浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、重结晶、相转移、色谱、酸溶碱沉等等，将由此所获得的化合物(vi)分离和纯化。此外，化合物(vi)不用分离就可以直接用于下一个反应。
步骤a-5
该步骤是化合物(vi)与化合物(vii)和过渡金属催化剂进行偶合反应、使化合物(vi)转化和化合物(i-a)的步骤。
可以按照本身已知的方法[例如，chemicalreviews，1995，vol.95，2457页，等等]，进行与过渡金属催化剂的反应，例如，在过渡金属催化剂和碱的存在下、在不会不利地影响该反应的溶剂中进行。
每1mol化合物(vi)，化合物(vii)的使用数量为大约1mol-大约100mol，优选大约1mol-大约10mol。
所使用的过渡金属催化剂的例子包括：钯催化剂(例如，醋酸钯(ii)等等)、镍催化剂(例如，氯化镍等等)，等等。在必要时，可以加入配体(例如、2，2’-二(二苯基膦基)-1，1’-联萘等等)，金属氧化物(例如，氧化铜、氧化银等等)可以用作助催化剂。同时，所使用的过渡金属催化剂的数量根据催化剂的种类而变化，通常，每1mol化合物(vi)，使用大约0.0001mol-大约1mol，优选大约0.01mol-大约0.5mol。每1mol化合物(vi)，所使用的配体或助催化剂的数量通常为大约0.0001mol-大约4mol，优选大约0.01mol-大约2mol。
所使用的碱的例子包括：有机胺(例如，三甲胺、三乙胺等等)、碱金属盐(例如，碳酸氢钠等等)、金属氢化物(氢化钾等等)、碱金属醇化物(甲醇钠等等)、碱金属二硅胺化物(例如，二硅胺化锂等等)，等等。它们当中，优选碱金属盐(碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等等)。
每1mol化合物(vi)，碱的使用数量通常为大约0.01mol-大约100mol，优选大约0.1mol-大约10mol。
在该步骤中，对溶剂没有特别限制，只要反应能够进行即可。
在该步骤中，反应温度通常为大约-50℃-大约200℃，优选大约-50℃-大约150℃。在该步骤中，反应时间通常为大约0.1小时-大约100小时。
在该步骤中，反应气体保护没有特别限制，可进行气体保护也可不保护，只要反应能够进行即可。保护气体包括：氮气、氩气等。
可以利用已知的分离和纯化方法，例如，浓缩、减压浓缩、溶剂提取、结晶、重结晶、相转移、色谱、酸溶碱沉等等，将由此所获得的化合物(i-a)分离和纯化。
实施例
在下文中，参照参比实施例、实施例、实验实施例和制剂实施例来更详细地解释本发明，但这些实施例不限制本发明，并且可以在本发明范围内进行改变。
在下面的实施例中，“室温”通常是指大约10℃至大约35℃。混合溶剂表示的比例是体积混合比例，除非另作说明。除非另作说明，否则，％是指wt％。
在硅胶柱色谱中，碱性硅胶是指使用氨基丙基硅烷结合的硅胶。在高效液相色谱(hp1c)中，c18是指使用十八烷基结合的硅胶。洗脱溶剂的比例是体积混合比例，除非另作说明。
参考实施例1
1-甲基-4-吡唑硼酸频哪醇酯
将4-碘吡唑(2g，10.3mmol)，碳酸钾(2.14g)，碘甲烷(1.72g)和25ml乙腈，回流反应12h。减压旋干，加入50ml水，分别用50ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，有机相加入无水na2so4干燥，减压干燥，得1-甲基-4-碘吡唑(2.1g)。
向1-甲基-4-碘吡唑(1.0g)和10mlthf中，氮气保护下，缓慢加入异丙基氯化镁/氯化锂溶液(3.97ml)，滴加过程中温度不超过0℃，加入后搅拌1h，后于0℃条件下，缓慢滴加异丙基频哪醇硼酸酯(1.11g)控制温度不超过0℃，加入后于室温条件下搅拌1.5h，反应完全后，滴加10ml饱和氯化铵溶液，淬灭。然后加入50ml乙酸乙酯和10ml饱和氯化铵溶液，分离有机层，水层分别加入50ml乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，加入无水na2so4干燥，减压干燥，得到标题产物(1g)。
ms(esi+)：[m+h]+209.3。
参考实施例2
1-乙基甲基醚-4-吡唑硼酸频哪醇酯
利用与参考实施例1一样的方法，由4-碘吡唑、2-溴甲基乙基醚、异丙基氯化镁/氯化锂溶液和异丙基频哪醇硼酸酯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+253.4。
参考实施例3
1-(2-羟基)乙基-4-吡唑硼酸频哪醇酯
利用与参考实施例1一样的方法，由4-碘吡唑、2-溴乙醇、异丙基氯化镁/氯化锂溶液和异丙基频哪醇硼酸酯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+239.2。
参考实施例4
1-丙烯酰基-3-羟甲基哌啶
向3-羟甲基哌啶(3g)，三乙胺(3.16g)和30ml二氯甲烷中，于-10℃条件下，缓慢加入丙烯酰氯(2.48g)，然后-10℃搅拌下反应2h。反应结束，减压旋干，加入25ml水，用50ml二氯甲烷萃取3次，合并有机层，有机相加入无水na2so4干燥，减压干燥，用硅胶柱色谱纯化残余物(碱性硅胶，己烷/乙酸乙酯)，得到标题化合(3.8g)。
ms(esi+)：[m+h]+170.1。
参考实施例5
1-丙烯酰基-3-羟基哌啶
利用与参考实施例9一样的方法，由3-羟基哌啶和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+156.5。
参考实施例6
1-丙烯酰基-4-羟甲基哌啶
利用与参考实施例9一样的方法，由4-羟甲基哌啶和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+170.1。
参考实施例7
1-丙烯酰基-3-羟基哌啶
利用与参考实施例9一样的方法，由4-羟基哌啶和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+156.5。
参考实施例8
1-丙烯酰基-3-羟甲基吡咯烷
利用与参考实施例9一样的方法，由3-羟甲基吡咯烷和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+156.2。
参考实施例9
1-丙烯酰基-3-羟基吡咯烷
利用与参考实施例9一样的方法，由3-羟基吡咯烷和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+142.6。
参考实施例10
1-丙烯酰基-3-羟基氮杂环丁烷
利用与参考实施例9一样的方法，由3-羟基氮杂环丁烷和丙烯酰氯获得标题化合物。
ms(esi+)：[m+h]+128.3。
参考实施例11
1-氰基-3-羟甲基哌啶
向3-羟甲基哌啶(3g)，碳酸钾(5.4g)和30ml甲醇中，于0℃条件下，加入溴氰(3.3g)，然后-室温搅拌下反应12h。反应结束，减压旋干，用硅胶柱色谱纯化残余物(碱性硅胶，己烷/乙酸乙酯)，得到标题化合(3.5g)。
ms(esi+)：[m+h]+141.1。
参考实施例12
1-氰乙酰基-3-羟基哌啶
将氰乙酸(2.1g)、hatu(18.8g)、diea(15.3g)和30ml二氯甲烷中，于0℃条件下，搅拌反应0.5h，然后，加入3-羟基哌啶(2g)，室温搅拌下反应12h。反应结束，减压旋干，用硅胶柱色谱纯化残余物(碱性硅胶，己烷/乙酸乙酯)，得到标题化合(2.5g)。
ms(esi+)：[m+h]+169.1。
实施例1
1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(3-羟基哌啶基)-2-丙烯-1-酮(1.7g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(2g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝1.6(m，2h)，1.9(m，1h)，2.1(m，1h)，3.1(m，2h)，4.2(m，2h)，4.6(m，1h)，4.7(m，1h)，5.7(dd，1h)，6.1(t，1h)，6.7to6.9(m，2h)，8.2(s，1h).
c)1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.15g)。
ms(esi+)：[m+h]+353.2。
实施例2至7
在实施例2至7中，利用与实施例1一样的方法，由实施例1的步骤b获得的1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮和任选被1至3个选自卤素原子、氰基、氨基、2-氰基乙酰基、c1-6醇、c1-6醇醚、c1-6的烷基、c2-8的环烷基烷基、c2-6的烯基和c2-6的炔基等等的取代基取代的5或6元单环杂环(例如，吡唑、吡咯等)(与实施例2至7的化合物对应)，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表1
实施例8
1-[3-((4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[3-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(3-羟甲基哌啶基)-2-丙烯-1-酮(1.9g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(2.1g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝1.5(m，2h)，1.9(m，1h)，2.1(m，1h)，3.1(m，2h)，3.6-3.8(m，2h)4.2(m，2h)，4.6(m，1h)，4.7(m，1h)，5.7(dd，1h)，6.1(t，1h)，6.9to7.1(m，2h)，8.3(s，1h).
c)1-[3-((4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[3-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.15g)。
ms(esi+)：[m+h]+367.5。
实施例9至14
在实施例9至14中，利用与实施例8一样的方法，由实施例8的步骤b获得的1-[3-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-l-哌啶基]-2-丙烯-1-酮和任选被1至3个选自卤素原子、氰基、氨基、2-氰基乙酰基、c1-6醇、c1-6醇醚、c1-6的烷基、c2-8的环烷基烷基、c2-6的烯基和c2-6的炔基等等的取代基取代的5或6元单环杂环(例如，吡唑、吡咯等)(与实施例9至14的化合物对应)，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表2
实施例15
1-[4-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[4-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(4-羟基哌啶基)-2-丙烯-1-酮(1.7g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(2g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝2.0(m，4h)，3.7(m，1h)，4.2(m，4h)，4.7(m，1h)，5.7(dd，1h)，6.1(t，1h)，7.2(m，2h)，8.2(s，1h).
c)1-[4-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[4-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.15g)。
ms(esi+)：[m+h]+353.2。
实施例16至21
在实施例16至21中，利用与实施例15一样的方法，由实施例15的步骤b获得的1-[4-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮和任选被1至3个选自卤素原子、氰基、氨基、2-氰基乙酰基、c1-6醇、c1-6醇醚、c1-6的烷基、c2-8的环烷基烷基、c2-6的烯基和c2-6的炔基等等的取代基取代的5或6元单环杂环(例如，吡唑、吡咯等)(与实施例16至21的化合物对应)，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表3
实施例22
1-[4-((4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[4-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(4-羟甲基哌啶基)-2-丙烯-1-酮(1.9g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(2.1g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝2.0(m，4h)，3.7(m，1h)，3.6-3.8(m，2h)4.2(m，4h)，4.6(m，1h)，4.7(m，1h)，5.7(dd，1h)，6.1(t，1h)，6.9to7.1(m，2h)，8.3(s，1h).
c)1-[4-((4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[3-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.15g)。
ms(esi+)：[m+h]+367.5。
实施例23至14
在实施例23至28中，利用与实施例22一样的方法，由实施例22的步骤b获得的1-[4-((4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)甲基)-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮和任选被1至3个选自卤素原子、氰基、氨基、2-氰基乙酰基、c1-6醇、c1-6醇醚、c1-6的烷基、c2-8的环烷基烷基、c2-6的烯基和c2-6的炔基等等的取代基取代的5或6元单环杂环(例如，吡唑、吡咯等)(与实施例23至28的化合物对应)，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表4
实施例29
1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(3-羟基吡咯烷基)-2-丙烯-1-酮(1.6g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(1.8g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝1.9(m，1h)，2.1(m，1h)，3.3(m，2h)，3.6(m，1h)，3.8(m，1h)，4.0(m，1h)，5.5(dd，1h)，6.1(t，1h)，6.6(m，1h)7.4(m，2h)，8.2(s，1h).
c)1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.13g)。
ms(esi+)：[m+h]+339.6。
实施例30至35
在实施例30至35中，利用与实施例29一样的方法，由实施例29的步骤b获得的1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮和任选被1至3个选自卤素原子、氰基、氨基、2-氰基乙酰基、c1-6醇、c1-6醇醚、c1-6的烷基、c2-8的环烷基烷基、c2-6的烯基和c2-6的炔基等等的取代基取代的5或6元单环杂环(例如，吡唑、吡咯等)(与实施例30至35的化合物对应)，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表5
实施例36
1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-杂氮环丁烷基]-2-丙烯-1-酮
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-吡咯烷基]-2-丙烯-1-酮
于0℃条件下，向4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，三苯基磷(7.3g)，1-(3-羟基杂氮环丁烷基)-2-丙烯-1-酮(1.6g)和四氢呋喃200ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(5.6g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(1.8g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝4.0(m，2h)，4.3(m，2h)，4.6(m，1h)，5.5(dd，1h)，6.1(t，1h)，6.6(m，1h)7.4(m，2h)，8.2(s，1h).
c)1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-杂氮环丁烷基]-2-丙烯-1-酮
于反应瓶中加入1-[3-(4-氨基-3-溴-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1杂氮环丁烷基]-2-丙烯-1-酮(0.2g)，碳酸钾(0.19g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(0.25g)和10ml1，4-二氧六环和2ml水，四(三苯基膦)钯(0.035g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.13g)。
ms(esi+)：[m+h]+325.3。
实施例37
1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-(n，n-二甲基氨基)乙酮丙腈
a)4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶
在室温下，向4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)和h2o25ml中，滴加溴(2g)，滴加完毕，于室温搅拌反应1h，然后在于回流条件下反应1h，减压旋干，在加入水中溶解，调节ph＝7，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物(2.5g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝6.7to6.9(m，2h)，8.3(s，1h)，13.2(s，1h).
b)3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-氨基
于反应瓶中加入4-氨基-3-溴吡唑并[3，4-d]嘧啶(2g)，碳酸钾(1.9g)，1-甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑(2.5g)和50ml1，4-二氧六环和10ml水，四(三苯基膦)钯(0.35g)，100℃搅拌反应过夜，并进行n2保护，反应结束，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(2g)。
1hnmr(300mhz，cdcl3)δ＝3.9(s，3h)，6.7to6.9(m，2h)，7.8(s，1h)，7.9(s，1h)，8.2(s，1h)，13.2(s，1h).
c)1-[3-(4-氨基-3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-1-哌啶基]-2-(n，n-二甲基氨基)乙酮
于0℃条件下，向3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-氨基(0.2g)，三苯基磷(0.63g)，1-(3-羟基哌啶基)-2-(n，n-二甲基氨基)乙酮(0.2g)和四氢呋喃20ml中，滴加偶氮二甲酸二异丙酯(0.45g)，滴加完毕，室温搅拌反应16h，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.2g)。
ms(esi+)：[m+h]+384.3。
实施例38至48
在实施例38至48中，利用与实施例37一样的方法，由实施例37的步骤b获得的3-(1-甲基-1h-4-吡唑基)-1h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-氨基和与实施例38至48的化合物所对应试剂，获得标题化合物。该表中的ms是指实测值。
表6
实验实施例(jak-1和jak-3酶抑制试验)
实验目的：
评价化合物对jak-1和jak-3激酶的抑制作用。
实验原理：
基于荧光共振能量转移技术(fret)偶联蛋白水解酶对特定磷酸化与非磷酸化多肽底物不同的蛋白水解作用。多肽底物两端分别标记为fret能量供体香豆素和能量受体荧光素，此时供、受体距离较近激发供体可以发生能量转移。
激酶反应(kinasereaction)中，jak-1或jak-3可以将atp中的γ-磷酸转移到多肽底物的单个酪氨酸残基上，如果体系中存在jak-1或jak-3抑制剂，则atp上的γ-磷酸基团不会被转移到底物多肽上，磷酸化反应不能发生。基于此原理设计了激酶抑制剂的评价实验，底物多肽设计有激酶磷酸化位点，同时也是蛋白酶切位点，两端分别接2种荧光基团，分别为供体和受体，反应体系中如果激酶活性保持，γ-磷酸基团则被转移到底物的酶切位点，从而不会被蛋白酶切割而分离成两段，在特定波长激光激发下，一段荧光的能量会被转移到另一端的荧光基团而发射能量。否则，及酶活性被抑制后，磷酸基团不能被转移，底物酶切位点会被体系中的酶切割，底物分离成两段，则不会发生荧光的能量转移。基于此评价激酶的活性。
实验步骤：
本实验选择10μ1激酶反应体系，首先每体系中加入2.5μl激酶(浓度1nm)，2.5μl多肽底物(浓度2μm)，2.5μlatp(浓度10μm)和2.5μl化合物，于室温下反应1h，后加入5μl检测液，室温反应1h，再加入5μl终止液。利用酶标仪(synergyh1，biotek，usa)，测定荧光强度(在400nm激发下，检测445nm下香豆素的发射和520nm下荧光素的发射强度)。计算每个化合物的抑制活性，其中，认为不含酶的孔的荧光强度是100％抑制。
表11
制剂实施例1(制备片剂)
将全部数量的1)、2)、3)和4)(30g)与水一起搅拌，真空干燥，并筛分。将筛分的粉末与4)(14g)和5)(1g)混合，并用压片机冲压该混合物，由此，获得1000个片剂，每片含有30mg的实施例1的化合物。
制剂实施例2(制备胶囊剂)
将1)、2)、3)和4)混合，并装填在胶囊中。
本发明的化合物具有优良的jak-1和/或jak-3抑制作用，其用作预防、治疗或改善自身免疫疾病(例如，牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等)等的药物。