本发明属于具有较好逆转肿瘤细胞耐药活性化合物的合成技术领域，具体涉及一种具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物及其合成方法和应用。
背景技术：
癌症是全球范围内的危害人类健康的疾病，2016年1月《ca：acancerjournalforclinicians》发表了我国国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据[1]。该研究分析结果提示，2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例。在中国，癌症已成为疾病死因之首，是亟待解决的非常重要的公共健康问题。化疗是肿瘤治疗的主要手段之一，但是多药耐药(multidrug-resistance，mdr)现象的产生限制了许多抗癌药物的临床使用。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其它的结构不同、作用机理不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药性的现象。研究表明mdr是导致50％以上肿瘤患者化学治疗失败的原因，是困扰肿瘤药物治疗的关键性难题[2]，如何逆转肿瘤细胞的多药耐药活性成为提高治疗效果函待解决的问题。
p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)于20世纪70年代在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现，它是atp(atp-bindingcassette，abc)膜转运系统超家族成员之一[3]。p-糖蛋白是atp偶联的跨膜蛋白，能利用atp水解释放的能量将疏水性药物转运至细胞外，或直接从细胞膜排除药物，使得细胞内药物浓度低于杀伤浓度而产生多药耐药。对p-gp逆转剂的作用机制研究可为逆转p-gp机制导致的肿瘤多药耐药性提供一定思路。随着对mdr，尤其是p-糖蛋白分子基础和作用机制研究的不断深入，新的mdr逆转剂不断在实验和临床上应用。目前针对p-糖蛋白的抑制剂的开发己历经三代[4]。
第一代p-糖蛋白抑制剂主要包括他莫昔芬、环孢素a、氯丙嗪、维拉帕米、奎宁、硝苯地平、噻吩嗪、三茴香基氯乙烯等，其中环孢素a与钙通道阻滞剂维拉帕米是典型代表。在体外实验中，第一代p-糖蛋白抑制剂可以较好逆转肿瘤细胞mdr。但在体内试验中，仅有少数药物对肿瘤耐药有效，且毒性很大，不能达到有效抑制mdr所需的浓度。此类药物通常缺乏p-糖蛋白的特异性，会产生较严重的副作用，如维拉帕米的心脏毒性、环孢素a的肾毒性及免疫抑制作用等。因此，第一代p-糖蛋白抑制剂作为逆转剂的临床应用受到很大程度的限制[5]。
为降低毒性和提高疗效，研究者开发了第二代耐药逆转剂。第二代p-糖蛋白抑制剂分为两种：其中一种是第一代p-糖蛋白抑制剂的同系物，如环孢菌素类似物伐司朴达(valspodar，psc833)、比利考达(vx710)、右旋维拉帕米(dexverapamil)、右旋尼古地平(dexniguldipine)等。另一种是新结构化合物，如s-9788、gf-12918、vx-710等。尽管psc833对p-糖蛋白是一个有效的抑制剂，但psc833同时也是人体中主要药物代谢酶－细胞色素氧化酶p4503a4(cyp3a4)的底物，它在抑制p-糖蛋白的同时，对cyp3a4降解的药物底物的清除有额外的影响。psc833的主要毒性是病人站立不稳(运动失调)。这些毒副作用和不可预知的药代动力学反应制约了第二代p-糖蛋白抑制剂的临床应用[6]。
近年来，随着化学信息学、计算化学、分子药理学及组合化学的发展，多药耐药抑制剂的研究获得飞速发展，人们研制出第三代p-糖蛋白抑制剂，其对p-糖蛋白更具特异性，作用更强。第三代p-糖蛋白抑制剂的主要代表物有tariquidar(xr9576)、zosuquidar()ly335979)、s9788、fc020326、粉防己碱(tetrandrine)、laniquidar(r101933)和elacridar(gfl20918)等。由于第三代p-糖蛋白抑制剂对p-糖蛋白有高度的特异性，所以不会对其他abc家族的转运蛋白产生抑制作用，从而避免产生其他副作用[7]。这类非竞争性p-糖蛋白抑制剂的出现，极大地促进了多药耐药逆转剂的研究，有效提高了抗癌药物的化疗药效。
本发明设计的取代喹啉和六氢吡啶修饰的甲醇衍生物是在第三代pgp抑制剂的结构基础上进行了结构调整和修饰，初步活性实验数据表明此类喹啉甲醇衍生物与阳性药物相比较具有较好的逆转肿瘤细胞耐药活性。
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[2]bairdr.d.；kayes.b.；drugresistancereversal-arewegettingcloser.[j]europeanjournalofcancer,2003,39(17):2450-2461。
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[4]palmeiraa.；sousae.；vasconcelosm.h.；etal.threedecadesofp-gpinhibitors:skimmingthroughseveralgenerationsandscaffolds[j]currmedchem,2012,19(13):1946-2025。
[5]李乾；江杰炜；张生烈；等.逆转肿瘤耐药的p-糖蛋白抑制剂研发新策略[j].药学,2013,37(7):313-320。
[6]schinkela.h.；jonkerj.w.；mammaliandrugeffluxtransportersoftheatpbindingcassette(abc)family:anoverview[j]advanceddrugdeliveryreviews,2012,64:138-153。
[7]kellyr.j.；draperd.；chenc.c.；etal.apharmacodynamicsstudyofdocetaxelincombinationwiththep-glycoproteinantagonist,tariquidar(xr9576)inpatientswithlung,ovarian,andcervicalcancer[j].clincancerres,2011,17(3):569-580。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一种具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物及其合成方法，该取代喹啉甲醇类化合物在喹啉的二位有芳基取代，四位有手性甲基取代，具有两个手性中心，通过对哌啶环上的氨氢上保护基的方法进行拆分其两个非对映异构体经过柱色谱分离，再通过一步水解去掉保护基得到两个极性不同的对应的甲氧基和哌啶取代的甲基喹啉内消旋化合物，其中对二甲胺基取代的化合物我们对其消旋化合物进行了进一步拆分得到四种立体异构体，该取代喹啉甲醇类化合物具有较为显著的逆转肿瘤细胞耐药活性。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物，其特征在于该取代喹啉甲醇类化合物的结构式为：
其中r＝4-n(ch3)2、3-cf3、3-cl或4-br。
进一步限定，所述取代喹啉甲醇类化合物为具有两个手性中心的化合物，该化合物具有两对对映异构体。
进一步限定，所述取代喹啉甲醇类化合物中
本发明所述的具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物的合成方法，其特征在于具体合成路线为：
其中r＝4-n(ch3)2、3-cf3、3-cl或4-br。
本发明所述的具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物在制备逆转肿瘤细胞耐药活性的多药耐药逆转剂中的应用。
进一步优选，所述具有逆转肿瘤细胞耐药活性的取代喹啉甲醇类化合物联合长春新碱在制备逆转肿瘤细胞耐药活性及杀死肿瘤细胞药物中的应用。
本发明制得的取代喹啉甲醇类化合物具有结构简单，合成路线简便，原料易得等优点，该取代喹啉甲醇类化合物在低浓度下逆转肿瘤细胞耐药活性达到阳性药物维拉帕米的八倍以上，具有较好的逆转肿瘤细胞耐药活性，与已知的常用抗癌药物联合使用能够起到降低癌细胞的耐药活性，从而提高化疗药物杀死癌细胞的效率，进而延长癌症患者的生存时间。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
其中r＝4-n(ch3)2、3-cf3、3-cl或4-br，对应的化合物依次为a、b、c、d。
以如下化合物为例进一步说明：
1.1(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(吡啶-2-基)甲酮2a的合成：
在氮气保护下，将2-溴吡啶(4.0eqv)加入含有干燥乙醚的三颈瓶中，将体系降温至-78℃，然后向体系滴加正丁基锂(2.5mol/l，4.0eqv)，反应约30min。然后将溶解在干燥四氢呋喃的1a(1.0eqv)缓慢滴加到反应体系中，此时升温至-70℃反应，反应结束后加水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏得到产物2a的粗产物，然后采用柱色谱分离化合物(体积比：石油醚/乙酸乙酯＝9/1)，最终制得产物2a，产率为78％。
1.2(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(吡啶-2-基)甲醇3a的合成：
将化合物2a(1.0eqv)溶解到无水乙醇中，加入硼氢化钠(2.0eqv)，在0℃反应，反应结束后加入水淬灭反应，体系有白色沉淀析出，抽滤并真空干燥得产物3a，产率为87％。1.3(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇4a的合成：
将化合物3a(1.0eqv)溶解到甲醇中，加入二氧化铂(0.3eqv)和浓盐酸，氢气下反应，反应结束后抽滤得到产品4a的甲醇滤液，减压蒸馏得到产物4a，产率为96％。
1.4(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(2-(n-叔丁氧基)哌啶)-甲醇5a，5a’的合成：
将化合物4a(1.0eqv)溶于15ml四氢呋喃中，冰浴下滴加0.43ml(3.0eqvl)三乙胺和0.218g(1.0eqv)二碳酸二叔丁酯后室温下搅拌过夜。加水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，柱色谱分离(体积比：石油醚/乙酸乙酯＝12:1)得到两对对映异构体5a，5a’，收率分别为48％和46％。
1.5化合物5a，5a’经过上海大赛璐公司的手性拆分得到四个立体异构体5a1，5a2，5a3和5a4，水解以后得到相应的去掉保护基的四个手性异构体即6a1，6a2，6a3和6a4。
1.6(2-(4-三氟甲基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)-甲醇6b1，6b2的合成：
将化合物5b和5b’溶解到甲醇中，加盐酸(2mol/l，1eqv)，于30℃进行脱保护基反应，反应结束后蒸干溶剂后抽滤，将固体用二氯甲烷洗涤得到对应的非对映异构体6b1和6b2(57％+35％)水解产物。
化合物的数据表征：
(2-(3-三氟甲基苯)喹啉-4-基)(吡啶-2-基)甲醇3b
白色固体.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.64(d,j＝4.8hz,1h),8.19(dd,j＝7.2,5.3hz,2h),8.09(d,j＝8.3hz,1h),8.01(ddd,j＝6.2,2.8,1.7hz,1h),7.98(s,1h),7.72(ddd,j＝8.3,6.9,1.2hz,1h),7.61–7.47(m,2h),7.46–7.36(m,2h),7.34–7.17(m,2h),7.10(d,j＝7.9hz,1h),6.50(s,1h),5.70(s,1h)。
(2-(3-氯苯基)喹啉-4-基)(吡啶-2-基)甲醇3c
白色固体1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.65(d,j＝4.6hz,1h),8.20(dd,j＝12.4,4.6hz,2h),7.78(s,1h),7.76–7.67(m,2h),7.61(td,j＝7.7,1.7hz,1h),7.54(ddd,j＝8.2,6.9,1.3hz,1h),7.51–7.45(m,1h),7.38(pd,j＝7.4,1.8hz,2h),7.24(d,j＝5.2hz,1h),7.15(d,j＝8.0hz,1h),6.46(s,1h),5.48(d,j＝2.4hz,1h)。
(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(2-(n-叔丁氧基)哌啶)-甲醇5a
橙色固体.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.65(dd,j＝3.7,1.2hz,1h),8.16–8.09(m,3h),8.09–8.03(m,1h),7.91(dd,j＝8.6,0.8hz,1h),7.58–7.45(m,2h),7.23–7.11(m,2h),7.02(d,j＝8.0hz,1h),6.89–6.83(m,2h),5.77(s,1h),3.06(s,6h),2.72–2.54(m,1h),2.37–2.22(m,1h),1.55(d,j＝32.4hz,3h),1.42–1.33(m,2h),1.34–1.31(m,1h),1.26(d,j＝6.3hz,1h),1.20(t,j＝6.5hz,1h),1.10–1.02(m,1h),1.03–0.71(s,9h).hplcpurity:(254nm)tr1＝4.678,tr2＝5.986。
(2-(4-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(2-(n-叔丁氧基)哌啶)-甲醇5a’
橙色固体.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.22–8.05(m,3h),7.94(s,1h),7.88(d,j＝8.3hz,1h),7.65(t,j＝7.6hz,1h),7.42(t,j＝7.5hz,1h),6.82(d,j＝7.9hz,2h),5.42(dd,j＝7.8,3.7hz,2h),3.05(s,6h),2.03–1.80(m,3h),1.48–1.15(m,8h),0.90–0.81(s,9h).hplcpurity:(254nm)tr1＝6.824,tr2＝8.519。
(2-(3-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6a1
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(2-(3-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6a2
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(2-(3-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6a3
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(2-(3-二甲胺苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6a4
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(2-(3-三氟甲基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6b1
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(2-(3-三氟甲基苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6b2
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(2-(3-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6c1
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(2-(3-氯苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6c2
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(2-(4-溴苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6d1
白色固体m.p.＝199-202℃1hnmr(600mhz,dmso)δ10.74(d,j＝8.9hz,1h),8.86(d,j＝8.4hz,1h),8.72(d,j＝9.9hz,1h),8.62–8.48(m,2h),8.46–8.29(m,2h),8.09(t,j＝7.5hz,1h),7.99–7.83(m,2h),7.72(t,j＝7.9hz,1h),6.27(s,1h),3.55(t,j＝10.8hz,1h),3.38(d,j＝11.2hz,1h),3.08(d,j＝11.1hz,1h),1.87(d,j＝12.8hz,1h),1.81–1.72(m,2h).hrms(esi),m/zcalcd.forc21h22brn2o([m+h]+)398.3235,found:398.3239。
(2-(4-溴苯基)喹啉-4-基)(哌啶-2-基)甲醇6d2
白色固体.m.p.＝197-199℃.1hnmr(600mhz,dmso)δ10.28(s,1h),8.54(s,1h),8.00(s,1h),7.92(d,j＝9.3hz,1h),7.84(d,j＝7.4hz,1h),7.77–7.59(m,2h),7.46(d,j＝6.9hz,2h),5.47(s,1h),3.37(s,1h),3.20(s,4h),2.96(s,4h),1.96–1.44(m,12h),1.48–1.17(m,5h),0.92(dd,j＝15.5,7.1hz,3h).hrms(esi),m/zcalcd.forc21h22brn2o([m+h]+)398.3235,found:398.3232。
2化合物的逆肿瘤细胞多药耐药活性实验研究
2.1肿瘤细胞耐药性的确定
细胞株：敏感性和耐药性人源性口腔表皮样癌细胞，kb和kb/vcr
实验方法：mtt法
实验步骤：
1.取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25wt％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液；
2.取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温co2培养箱中培养；
3.24小时后，加入受试药物(20μl/孔)，培养72小时；
4.将mtt试剂加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中孵育4小时；
5.吸去上清液，加入dmso(150-200μl/孔)，平板摇床上振摇至甲瓒完全溶解；
6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算相应的细胞抑制率。
实验结果：
结论：kb/vcr细胞株的耐药倍数为55-65倍。
2.2逆转肿瘤多药耐药化合物的筛选
实验方法：流式细胞术
实验步骤：
1.取处于指数生长期状态良好的细胞，加入0.25wt％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液；
2.取细胞悬液接种于12孔板上，1ml/孔，置恒温co2培养箱中培养；
3.24小时后，更换无血清的培养基，并加入受试药物和阳性药(verapamil维拉帕米)100μl/孔，培养4小时；
4.然后加入5μg/mlrhodamine123，避光37℃孵育1小时；
5.用4℃预冷的pbs缓冲液洗涤细胞，0.25wt％胰蛋白酶消化使贴壁细胞脱落后，用4℃预冷的pbs缓冲液重悬细胞；
6.使用流式细胞仪进行检测。
实验结果：
使用流式细胞术从合成的化合物中筛选出抑制rhodamine123的胞内蓄积作用，结果表明其中的6a3，6a4，6b1，6c1，6c2，6d1抑制rhodamine123的胞内蓄积作用显著大于阳性对照药verapamil维拉帕米，其作用都超过维拉帕米40倍以上。
2.3验证化合物的耐药逆转作用
2.3.1测试化合物的抗肿瘤活性及确定其耐药活性实验的的浓度
实验方法：mtt
实验步骤：
1.取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25wt％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液；
2.取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温co2培养箱中培养；
3.24小时后，加入受试药物(20μl/孔)，培养72小时；
4.将mtt试剂加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中孵育4小时；
5.吸去上清液，加入dmso(150-200μl/孔)，平板摇床上振摇至甲瓒完全溶解；
6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算相应的细胞抑制率。
通过mtt实验法测试了甲基喹啉化合物7系列在不同浓度下(1.0μm，2.5μm，5μm，10μm)的抗肿瘤活性，根据实验结果选择化合物抗肿瘤抑制率≤10％的浓度进行下一步逆转肿瘤耐药倍数的实验。最终选取了每个化合物的逆转耐药实验的浓度(抑制率≤10％)，分别为6a3(2.5μm)，6a4(2.5μm)，6b1(2.5μm)，6b2(2.5μm)，6c1(1μm)，6c2(1μm)，6d1(1μm)。
2.3.2化合物逆转肿瘤耐药数据的测定
实验方法：mtt
实验步骤：
1.取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25wt％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液；
2.取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温co2培养箱中培养；
3.24小时后，分别加入候选化合物和化疗药物(20μl/孔)，培养72小时；
4.将mtt试剂加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中孵育4小时；
5.吸去上清液，加入dmso(150-200μl/孔)，平板摇床上振摇至甲瓒完全溶解；
6.用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算相应的细胞抑制率。
实验结果：
化合物联合长春新碱(vcr)逆转肿瘤耐药倍数，n>3
实验结论：
实验结果表明，逆转肿瘤细胞耐药的作用明显高于阳性药verapamil的化合物有6种，分别为6a4，6b1，6b2，6c1，6c2，6d1，均具有较为显著的逆肿瘤细胞耐药活性。
本发明合成的取代喹啉甲醇类化合物具有结构简单，合成路线简便，原料易得等优点，该取代喹啉甲醇类化合物具有良好的逆转肿瘤细胞耐药活性，与已知的常用抗癌药物一起能够起到降低癌细胞的耐药性，从而提高化疗药物杀死癌细胞的效率，进而可能延长癌症患者的生存时间。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。