一种具有核靶向功能的非病毒基因载体的制备方法与流程

本发明涉及基因药物控释技术领域，尤其涉及一种可以将负载基因靶向输送到细胞核靶向的非病毒基因载体，还涉及运用该载体材料制备的聚合物纳米颗粒的制备方法。

背景技术：

癌症是在世界范围内具有很高的发病率和致死率，随着对肿瘤发生发展分子机制认识的不断深入，发现肿瘤的发生是一个极其复杂的过程，许多基因的抑制，过度表达或突变都可导致肿瘤的发生。因此肿瘤的基因治疗已成为攻克和治愈肿瘤最具希望和挑战的研究领域。肿瘤的基因治疗系将具有正常功能的基因或者治疗作用的基因通过特定的方式导入进肿瘤靶细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。在肿瘤基因治疗的实施过程中，除了寻找有效的治疗基因外，一个高效安全的载体，能够将基因有效地输送至肿瘤组织，同样是肿瘤治疗中一个非常重要的环节。目前应用的基因载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。由于对病毒基因组的认识较为清楚，且转染效率高，病毒载体被广泛用于基因治疗研究和临床试验。然而其存在的问题，如可以诱导机体产生某种程度的免疫反应、插入突变致瘤、致毒风险、载体容量有限、制备重复度不高等缺点，使得人们将研究越来越多转向非病毒载体。非病毒载体运用理化方法介导基因转移，除具备无传染性、不限制载体容量、化学结构可控及易于大量制备等优点外，与病毒载体相比，还具有低毒、低免疫反应，所携带的目的基因不整合至宿主细胞基因组等优势，因此，非病毒载体近年来发展迅速。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和脂质体，相对而言，基于聚合物的非病毒载体比起阳离子脂质体的优势在于它更为安全，易于大量生产，且更为稳定。到现在为止，大量的合成或者是天然的聚合物阳离子载体被研究用作基因载体，这包括聚乙烯亚胺(pei)，壳聚糖，聚酰胺-胺树枝状分子(pamam)等阳离子聚合物。然而，聚合物阳离子载体转染效率远不及病毒传递系统，却是这类载体的通病，究其原因，主要是其dna细胞核转移效率不高造成的。细胞核是细胞体内非常重要的一种细胞器，是基因编码及转录的主要场所，本发明的主要目的是合成一种细胞核靶向的基因载体，从而解决非病毒基因载体转染效率不高的问题。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是开发一种具有核靶向功能的非病毒基因载体的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

(1)1代pamam基元(d1)的合成：冰水浴下，氮气保护，将乙二胺溶于甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。滴加完成后，先在0℃下搅拌，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到0.5代含炔基的pamam基元d0.5。冰水浴下，氮气保护，将d0.5溶于甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液。滴加完成后，先在0℃下搅拌反应，然后在室温下搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到d1。

(2)2代ss-d2的合成：冰水浴下，氮气保护，将d1溶于甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。滴加完成后，搅拌1h，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到ss-d1.5基元。冰水浴下，氮气保护，将ss-d1.5溶于甲醇中，缓慢滴入胱胺的甲醇溶液中。滴加完成后，下搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应48h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的胱胺与甲醇，真空干燥得到含二硫键的ss-d2。

(3)3代ss-d3的合成：冰水浴下，氮气保护，将ss-d2溶于甲醇中，缓慢滴入丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。滴加完成后，先在0℃下搅拌1h，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到2.5代ss-d2.5基元。冰水浴下，氮气保护，将ss-d2.5基元溶于甲醇中，缓慢滴入乙二胺的甲醇溶液中。2h滴加完成后，搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应48h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到ss-d3。

(4)将ss-d3和三乙醇胺溶于甲醇中，缓慢滴加含有[n-2-(甲酰基-乙基)]-马来酰亚胺的甲醇溶液，先在0℃下搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应24h，反应结束后，旋转蒸发除去甲醇，然后将得到的产物溶于水中，于透析袋中进行透析24h，冷冻干燥得到[n-2-(甲酰基-乙基)-马来酰亚胺]-ss-d3。

(5)将[n-2-(甲酰基-乙基)-马来酰亚胺]-ss-d3溶于ph7.4pbs的缓冲溶液中，然后缓慢滴入核靶向多肽pbs缓冲溶液，避光搅拌反应24h。反应结束后，将反应液转入透析袋中，透析24小时，冷冻干燥得核靶向基因载体。

(6)将步骤(5)中合成的核靶向基因载体和质粒或sirna溶于pbs中，搅拌均匀后放置30分钟，使其形成稳定的复合物。

本发明步骤一中所述的丙烯酸甲酯的加入摩尔量相当于乙二胺的4～8倍；优选为5倍。

本发明步骤一中所述的乙二胺的用量为d0.5摩尔量的4～8倍。

本发明步骤一中所述的反应的温度优选为0～5℃。

本发明步骤二中所述的丙烯酸甲酯的加入摩尔量相当于d1的8～12倍；优选为10倍。

本发明步骤二中所述的胱胺的用量为d1.5摩尔量的8～12倍。

本发明步骤三中所述的丙烯酸甲酯的加入摩尔量相当于ss-d2的16～32倍；优选为18倍。

本发明步骤三中所述的乙二胺的用量为ss-d2.5摩尔量的16～30倍。

本发明步骤四中所述的[n-2-(甲酰基-乙基)]-马来酰亚胺用量为ss-d3摩尔量的1～2倍。

本发明步骤四中所述的透析袋分子截留量为3000～5000。

本发明步骤五中所述的核靶向多肽为hiv-1反式转录激活因子。

本发明步骤六中所述的质粒可为p53，p16，apc，rb，dcc，所述的sirna可为vegf-sirna，bcl-2-sirna，survivin-sirna。

本发明的纳米载体的制备方法制备的载体-基因复合物纳米颗粒粒径在100～130纳米。

本发明的聚合物基因纳米载体：细胞膜穿透肽的修饰使基因载体材料表面带上了细胞核的识别分子，能够使更多的基因随着载体进入细胞核。核靶向功能使载体靶向到细胞核。除此之外，由胱胺形成的d2层中，是由二硫键和d3层连接的，二硫键能够智能响应肿瘤细胞内较高的谷胱甘肽浓度从而发生断裂，进而进一步提高基因进入细胞核中的效率，进一步提高载体的转染率。

附图说明

图1为mal-ss-d3和tat-ss-d3的核磁氢谱图。

图2为tat-d3/p53和tat-ss-d3/p53复合物透射电镜图。

图3为载体/p53复合物的zeta电位测定。

图4为fitc标记的载体的共聚焦显微镜图及流式检测图，(1)pamam-d3(2)ss-pamam-d3(3)tat-pamam-d3(4)tat-ss-pamam-d3。

图5为载体转染pegfp-53的共聚焦显微镜图及转染率(1)d3(2)ss-d3(3)tat-d3(4)tat-ss-d3。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

(1)1代pamam基元(d1)的合成：冰水浴下，氮气保护，将1g乙二胺溶于甲醇中，缓慢滴入含有4.48g丙烯酸甲酯的100ml甲醇溶液中。滴加完成后，先在0℃下搅拌，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到0.5代含炔基的pamam基元d0.5。冰水浴下，氮气保护，将d0.5溶于甲醇中，缓慢滴入含有5g乙二胺的甲醇溶液。滴加完成后，先在0℃下搅拌反应，然后在室温下搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到d1。

(2)2代ss-pamam基元(d2)的合成：冰水浴下，氮气保护，将2gd1溶于甲醇中，缓慢滴入含有3.2g丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。滴加完成后，搅拌1h，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到1.5代含d1.5基元。冰水浴下，氮气保护，将d1.5基元溶于20ml甲醇中，缓慢滴入含有8.46g胱胺的甲醇溶液中。滴加完成后，下搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应48h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的胱胺与甲醇，真空干燥得到含二硫键的d2(ss-d2)

(3)3代ss-d3的合成：冰水浴下，氮气保护，将4gss-d2溶于甲醇中，缓慢滴入含有2.57g丙烯酸甲酯的甲醇溶液中。滴加完成后，先在0℃下搅拌1h，然后升温至室温搅拌反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的丙烯酸甲酯与甲醇，真空干燥得到2.5代ss-d2.5基元。冰水浴下，氮气保护，将ss-d2.5基元溶于甲醇中，缓慢滴入含有2.87g乙二胺的甲醇溶液中。2h滴加完成后，搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应48h。反应结束后，旋转蒸发除去未反应的乙二胺与甲醇，真空干燥得到ss-d3。

(4)将4gss-d3和0.1g三乙醇胺溶于甲醇中，缓慢滴加含有0.2g[n-2-(甲酰基-乙基)]-马来酰亚胺的甲醇溶液，先在0℃下搅拌反应1h，然后在室温下搅拌反应24h，反应结束后，旋转蒸发除去甲醇，然后将得到的产物溶于水中，于透析袋中进行透析24h，冷冻干燥得到[n-2-(甲酰基-乙基)-马来酰亚胺]-ss-d3(mal-ss-d3)。

(5)将4g[n-2-(甲酰基-乙基)-马来酰亚胺]-ss-d3溶于ph7.4pbs的缓冲溶液中，然后缓慢滴入含有0.05g核靶向多肽tatpbs缓冲溶液，避光搅拌反应24h。反应结束后，将反应液转入透析袋中，透析24小时，冷冻干燥得核靶向基因载体(tat-ss-d3)。

实施例2

本实施例是将实施例1中的p53质粒换为p16质粒，其他方法同实施例1。

实施例3

本实施例是将实施例1中的p53质粒换为apc质粒，其他方法同实施例1。

实施例4

本实施例是将实施例1中的p53质粒换为dcc质粒，其他方法同实施例1。

实施例5

本实施例是将实施例1中的p53质粒换为vegf-sirna，其他方法同实施例1。

实施例6

本实施例是将实施例1中的p53质粒换为bcl-2-sirna，其他方法同实施例1。

表征方法：

各聚合物取约10mg溶于适量氘代溶剂，用1h-nmr400mhzbruker核磁共振波谱仪进行测试，检测后聚合物结构上1h化学位移的变化，测试结果见图1。图1分别给出了mal-ss-d3和tat-ss-d3的核磁氢谱图，两者相对比，mal-ss-d3在6.65ppm处有一个明显的双峰，这是马来酸上双键的特征峰。而在tat-ss-d3的核磁氢谱图中，由于tat上的巯基和马来酸上的双键发生了点击反应，因此双键消失，这说明tat成功地连接到了ss-d3上。

用透射电镜(tem)观察胶束的形貌，简要操作如下：取4μl样品(0.25mg/ml)滴在纯碳膜铜网上，在室温下晾干，用3％的醋酸铀染色3min；然后用透射电镜在120kv下观察，检测结果见图2。不论是tat-pamam-d3/p53还是tat-ss-pamam-d3/p53复合物，在电镜下都观察到了球形规则的形貌。不同的是tat-ss-pamam-d3/p53在gsh的作用下，粒径由原来的100nm变成了45nm作用，说明二硫键能够响应gsh，在gsh的作用下发生断裂，形成粒径更小的复合物，这更有利于复合物穿过核孔进入细胞核发挥作用。

用zeta电位检测复合物的电势，电势值取三次测量值的平均值，检测结果见图3。由检测结果可知，无论是有无gsh的作用，tat-d3的zeta电位值随着n/p值的上升而上升，当n/p值大于10后电位值变化不大。而在有gsh的作用下，即使是n/p值达到40时，tat-ss-d3的zeta电位值仍然为负值，这是由于二硫键断裂导致剩余的巯基留着载体表面，而巯基是带负电的。tat-d3没有这种响应性，因为tat-d3没有二硫键。

图4为fitc标记的载体与hela细胞孵育24小时后共聚焦显微镜图及流式检测图，由图4可知tat-ss-d3组进入到细胞核的最多，流式检测结果显示66.3％的tat-ss-d3进入到了细胞核中，而pamam-d3,ss-pamam-d3和tat-pamam-d3只有10.1％，23.5％和40.3％进入到了细胞核中，说明tat的修饰加上二硫键的连接更能够促进载体进入到细胞核中。

图5为各载体负载了pegfp-53质粒，和细胞共同孵育24小时后拍摄的共聚焦显微镜照片及转染率检测结果，从共聚焦显微镜图可知，tat-ss-d3组中表达绿色荧光蛋白最多，相对而言，tat-d3组排第二，d3组和ss-d3组的图中只观察到了少量的绿色荧光蛋白表达。流式检测转染绿色荧光蛋白的结果显示，d3组的转染率只有10.1％，ss-d3和tat-d3的转染率分别是21.5％和34.3％，而tat-ss-d3却达到了48.5％，这一结果和共聚焦显微镜观察到的结果是类似的，再一次说明了tat的修饰加上二硫键的连接设计可以大大地提高转染效率。

各载体负载了p53质粒后，经凋亡检测试剂检测得到的凋亡率检测结果。ss-d3,tat-d3和tat-ss-d3转染p53后引起的细胞凋亡率分别为11.3％，24.6％和42.7％，说明tat-ss-d3能够高效地将p53质粒转入细胞中，从而引起更多的肿瘤细胞凋亡。