检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法与流程

本发明涉及一种核酸的测定和检验方法，特别是涉及一种利用聚合酶连锁反应检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法。

背景技术：

鲤浮肿病毒(carpedemavirus，cev)为锦鲤睡眠病(koisleepydisease,ksd)的致病原，其隶属于痘病毒科(poxviridae)。锦鲤睡眠病是一种表现为典型昏睡行为的新兴传染病，临床症状主要表现为极度嗜睡、眼睛凹陷、全身水肿、皮肤和鳍上分布着厚厚的粘液，以及鳃增生和坏死导致呼吸困难和缺氧，其死亡率高达80％至100％。

锦鲤睡眠病的发病温度较广，7℃至25℃的条件下均可发病。鲤科鱼类感染鲤浮肿病毒后，所出现的临床症状和锦鲤疱疹病毒病(koiherpesvirusdisease,khvd)类似，例如表现为昏睡、鳃溃疡、眼球凹陷、皮肤损伤等。目前，锦鲤睡眠病对欧洲鲤科鱼类造成巨大损失，引起世界动物卫生组织的关注。在我国，也从河南、重庆、云南等地的锦鲤等鲤科鱼类检测到鲤浮肿病毒，显示鲤浮肿病毒已在我国鲤科鱼类养殖体系流行，并有进一步扩大传播的趋势，这将对我国锦鲤等观赏鱼进出口贸易和国内鲤科鱼类造成极大影响。然而，由于世界动物卫生组织(worldorganisationforanimalhealth,oie)和亚太区水产联盟(networkofaquaculturecentresinasia-pacific,naca)等动物卫生组织没有推荐检测鲤浮肿病毒相应的技术规范，且文献报导相对有限，成为鲤浮肿病毒实验室检测和防控的瓶颈。

因此，开发快速、方便及准确诊断鲤浮肿病毒的检验方法，以方便锦鲤睡眠病的现场或实验室检测至为关键。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的一目的是在提供一种检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检测方法，可以快速且特异性的从待测样本中检测鲤浮肿病毒。

本发明的一方案是提供一种检测鲤浮肿病毒的试剂盒，包含一引物对，所述引物对包含一序列标记编号1所示的正向引物以及一序列标记编号2所示的反向引物。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，可进一步包含一接样环组件，用以将一待测样本转移至一试验管中。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，可进一步包含一阳性对照组核酸干粉。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，可进一步包含一如序列标记编号3所示的萤光探针。

本发明的另一方案是在提供一种检测鲤浮肿病毒的检验方法，包含以下步骤。提供一待测样本作为一模板。将所述模板以前段所述的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行聚合酶连锁反应，以获得一聚合酶连锁反应产物，而所述检测鲤浮肿病毒的试剂盒包含一引物对，所述引物对包含序列标记编号1所示的正向引物以及序列标记编号2所示的反向引物。最后检测所述聚合酶连锁反应产物的分子量大小是否为80bp。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的检验方法，其中，所述聚合酶连锁反应产物可具有如序列标记编号4所示的序列。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的检验方法，其中，检测所述聚合酶连锁反应产物可通过胶体电泳系统进行。

本发明的又一方案是提供一种检测鲤浮肿病毒的检验方法，包含以下步骤。提供一待测样本作为一模板。将所述模板以前段所述的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行一萤光探针式聚合酶连锁反应，所述检测鲤浮肿病毒的试剂盒包含一引物对和一萤光探针，所述引物对包含序列标记编号1所示的正向引物和序列标记编号2所示的反向引物，所述萤光探针具有如序列标记编号3所示的序列。最后检测是否具有一萤光信号值。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的检验方法，其中，所述萤光探针式聚合酶连锁反应可为即时聚合酶连锁反应(real-timepcr)。

依据前述的检测鲤浮肿病毒的检验方法，其中，所述萤光探针式聚合酶连锁反应可为隔绝恒温式聚合酶连锁反应(insulatedisothermalpcr,iipcr)。

由此，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法，能快速、特异、方便且准确地检测待测样本中是否存在鲤浮肿病毒。本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法的检测结果除了可经由一般常规跑胶确认结果外，也可进行萤光聚合酶连锁反应及隔绝恒温式聚合酶连锁反应确认结果，其中尤其隔绝恒温式聚合酶连锁反应的检测结果不需复杂的资料判读，即使未受过专业训练的人员，也能利用本发明的试剂盒及检验方法进行鲤浮肿病毒的检测。此外，若搭配轻便、易携带，结合可携式的萤光核酸分析仪，可用于田野间水产养殖渔业的检测，能快速且准确的诊断病原感染以供提早防治。

上述发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，针对附图的说明如下。

图1表示依照本发明的一实施方式的检测鲤浮肿病毒的试剂盒的结构示意图。

图2表示本发明的另一实施方式的检测鲤浮肿病毒的检验方法的步骤流程图。

图3表示本发明的又一实施方式的检测鲤浮肿病毒的检验方法的步骤流程图。

图4为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒的检测灵敏度分析结果图。

图5为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒的检测特异性分析结果图。

图6为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应的胶体电泳分析图。

其中，附图标记说明如下：

100：检测鲤浮肿病毒的试剂盒。

110：盒体。

120：盒盖。

200：内衬。

210：第一回溶液模组。

220：阳性对照模组。

230：第二回溶液模组。

300：接样环组件。

310：接样环。

400：预混试剂组件。

500：检测鲤浮肿病毒的检验方法。

510、520、530：步骤。

600：检测鲤浮肿病毒的检验方法。

610、620、630：步骤。

具体实施方式

本说明书公开的内容提供一种快速检测鲤浮肿病毒的试剂盒以及其检验方法。其中，以鲤浮肿病毒的高度保留区设计特异性引物对，以包含引物对的试剂盒与待测样本进行聚合酶连锁反应，当有聚合酶连锁反应产物时，为待测样本中存在鲤浮肿病毒的表征。并可进一步地设计与鲤浮肿病毒具有特异性的萤光探针，以包含引物对及萤光探针的试剂盒，与待测样本进行萤光探针式聚合酶连锁反应，当有萤光讯号时，为待测样本中存在鲤浮肿病毒的表征。

本发明前述所称的“萤光探针”是指一包含连续至少8个核苷酸的分子，其为选取pcr上下游引物之间的一段序列作为探针，并在探针的5`-端标记上萤光基团(reporter)，3`-端标记上相应的萤光淬灭剂(quencher)，由于两个基团靠得很近，构成萤光能量传递的关系，没有萤光信号产生，在每一个循环的退火(annealing)过程中，该探针可以与模板相结合，随后的延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端，并因此使萤光基团与萤光淬灭剂上的淬灭基团分离，让萤光基团释放出萤光。例如萤光探针的5'端萤光基团可使用fam(520nm)或joe、vic(550nm)等，而萤光探针的3'端萤光淬灭剂可使用黑洞淬灭剂(blackholequencher)(bhq1)或是非荧光淬火剂(nonfluorescentquencher)(nfq)等，然其仅为示例不作为本发明的限定。

本发明前述所称的“隔绝恒温式聚合酶连锁反应(insulatedisothermalpcr,iipcr)”为一新的萤光检测技术，以单点温度控制并利用热对流的原理，完成聚合酶连锁反应过程中解离dna双股结构的反应(denaturing)、引物退火反应(annealing)和延长反应(extension)等三步骤的循环。因只需底部单一温度控制，且以自然的温度梯度取代机械式的升降温，可使机器更轻量化、避免机器因反复升降温造成机械故障，以及省下升降温所需的时间。因检测结果不需资料判读，即使未受过专业训练的人员，也能利用本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及检测方法进行鲤浮肿病毒的检测。

下列实验例用于示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域通常知识者，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些实验例视为对本发明范围的限制，仅是用于如何实施本发明的材料及方法。

[检测鲤浮肿病毒的试剂盒]

本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，包含一引物对，所述引物对包含一序列标记编号1所示的正向引物以及一序列标记编号2所示的反向引物。优选地，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒可进一步包含如序列标记编号3所示的萤光探针。更优选地，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒可进一步包含一接样环组件，用以将一待测样本转移至一试验管中，以及可进一步包含一阳性对照组核酸干粉，用以作为阳性对照组。

请参照图1，表示依照本发明的一实施方式的检测鲤浮肿病毒的试剂盒100的结构示意图。检测鲤浮肿病毒的试剂盒100包含盒体110、盒盖120、内衬200、接样环组件300和预混试剂组件400。

盒盖120用于盖合盒体110，盒盖120的内表面设置有海绵缓冲层。内衬200、接样环组件300和预混试剂组件400依序设置于盒体110内。

内衬200包含第一回溶液模组210、阳性对照模组220和第二回溶液模组230。第一回溶液模组210设有相应的孔位，用以放置溶解混合引物的第一缓冲试剂。阳性对照模组220用以放置阳性对照组核酸干粉，所述阳性对照组核酸为内含鲤浮肿病毒的全基因的质体。第二回溶液模组230用以放置溶解阳性对照组核酸干粉的第二缓冲试剂。

接样环组件300包括至少一袋独立包装的接样环包，每袋接样环包内放置有若干个接样环310。

预混试剂组件400包括至少一袋独立包装的预混试剂包，每袋预混试剂包内有若干管预混试剂管，预混试剂管内放置冻干粉末，冻干粉末包括dntps、引物对、萤光探针和萤光pcr反应酶。其中引物对包含序列标记编号1所示的正向引物以及序列标记编号2所示的反向引物。萤光探针的序列如序列标记编号3所示，于此实施例，萤光探针的3’端具有nfq萤光淬灭剂，5’端具有fam萤光基团修饰。

检测鲤浮肿病毒的试剂盒100中预混试剂管为预先混好的预混形式，未添加rox参比染料，使用时只需将预混试剂管的冻干颗粒、第一回溶液模组210内的第一缓冲试剂混合，并以接样环310将待测样本转移至预混试剂管中，即可开始反应。如需要加入萤光染料校正即时(real-time)pcr仪器，可依照各实验室的标准试验流程加入rox参比染料即可。检测鲤浮肿病毒的试剂盒100简单、方便携带，可常温携带和保存。并且，如果对检测鲤浮肿病毒的试剂盒100进行铝箔包装密封，冷冻保存于-20℃则可存放1年以上效能不变。

[检测鲤浮肿病毒的检验方法]

请参照图2，表示本发明的另一实施方式的检测鲤浮肿病毒的检验方法500的步骤流程图。检测鲤浮肿病毒的检验方法500包含步骤510、步骤520和步骤530。

步骤510为提供一待测样本作为一模板。所述待测样本可为鱼的鱼鳃样本、肝脏样本、胸腺样本及消化道器官样本。并可进一步利用商业萃取试剂套组或其他公知方法萃取待测样本中的核酸，其步骤及原理是相关领域中具有通常知识者所知悉的，因而此处不再详细赘述。

步骤520为将所述模板以包含序列标记编号1所示的正向引物以及序列标记编号2所示的反向引物的引物对进行聚合酶连锁反应，以获得一聚合酶连锁反应产物。

步骤530为检测所述聚合酶连锁反应产物的分子量大小是否为80bp。若聚合酶连锁反应产物的分子量大小为80bp，则表示待测样本中存在鲤浮肿病毒。优选地，聚合酶连锁反应产物具有如序列标记编号4所示的序列。而聚合酶连锁反应产物可以胶体电泳系统进行检测。

请参照图3，表示本发明的另一实施方式的检测鲤浮肿病毒的检验方法600的步骤流程图。检测鲤浮肿病毒的检验方法600包含步骤610、步骤620和步骤630。

步骤610为提供一待测样本作为一模板。所述待测样本可为鱼的鱼鳃样本、肝脏样本、胸腺样本及消化道器官样本。并可进一步利用商业萃取试剂套组或其他公知方法萃取待测样本中的核酸，其步骤及原理是相关领域中具有通常知识者所知悉的，因而此处不再详细赘述。

步骤620为将所述模板以序列标记编号1所示的正向引物、序列标记编号2所示的反向引物以及序列标记编号3所示的萤光探针进行一萤光探针式聚合酶连锁反应。优选地，萤光探针式聚合酶连锁反应可为即时聚合酶连锁反应(real-timepcr)或隔绝恒温式聚合酶连锁反应(insulatedisothermalpcr,iipcr)。

步骤630为检测是否具有一萤光信号值，若具有萤光信号值，则表示待测样本中存在鲤浮肿病毒。

[试验例]

1.即时聚合酶连锁反应

请参照图1和图3，详细地，若以检测鲤浮肿病毒的试剂盒100进行即时聚合酶连锁反应以检测鲤浮肿病毒为例，先以100μl的第二缓冲试剂溶解阳性对照组核酸干粉，以获得浓度为4×10^-5ng/μl的阳性对照，并将回溶后的阳性对照保存于4℃备用。再打开预混试剂包，并根据待测样本数取出对应量的预混试剂管。

而预混试剂管中冻干颗粒回溶方式如下列步骤。若不需添加rox参比染料，打开管盖，每一管预混试剂管加入50μl的第一缓冲溶液回溶冻干颗粒，即获得即时聚合酶连锁反应混合液。即时聚合酶连锁反应混合液中，dntps的浓度为0.5mm、引物对的浓度为0.5μm、萤光探针的浓度为0.05μm、萤光pcr反应酶的浓度为35u/μl。若需添加rox参比染料校正即时(real-time)pcr仪器，每一管预混试剂管加入49μl的第一缓冲溶液和1μl的rox参比染料回溶冻干颗粒。

将回溶好的冻干颗粒溶液每管取23μl分装到0.2ml的萤光pcr专用反应管中。取2μl的待测样本、阳性对照或阴性对照，加入含有23μl冻干颗粒溶液的萤光pcr专用反应管。其中，阴性对照不含有靶标基因的核酸。

再依据反应条件进行扩增反应。探针检测模式设置为：reporterdye-fam、quencherdye-mgb或none，依机型而定。反应条件设定为93℃反应15秒、60℃反应60秒，共40次循环。

反应结束后保存检测资料档案，并进一步进行结果判定。分析条件设置为先设定标准曲线中阳性标准品的量。再点击程序的自动分析功能，获得分析结果。其中阳性标准品的ct值<32，即表示整组试剂效能及反应正常。若在fam通道扩增曲线有明显对数增长，则为阳性结果，表示待测样本中存在鲤浮肿病毒。若在fam通道扩增曲线无对数增长，则为阴性结果，表示待测样本中不存在鲤浮肿病毒，或是存在低于检测灵敏度的病毒量。

以下的试验例以本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法对330份锦鲤及鲤鱼的待测样本进行检测，并与英国cefaswweymouth实验室建立的即时聚合酶连锁反应检测方法进行比较检测，cefaswweymouth实验室的即时聚合酶连锁反应检测方法可参考：matrasm,borzyme,stoned,etal.carpedemavirusinpolishaquaculture-evidenceofsignificantsequencedivergenceandanewlineageincommoncarpcyprinuscarpio(l.)[j].journaloffishdiseases,2016,40(3):319-325。

结果显示，利用本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法，可从330份锦鲤及鲤鱼的待测样本中筛选出12份阳性结果样本，而以英国cefaswweymouth实验室建立的即时聚合酶连锁反应检测方法仅检测出9份阳性结果样品。其中以本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法所检测出的12份阳性结果样本中，包含了以英国cefaswweymouth实验室建立的即时聚合酶连锁反应检测方法所检测出的9份阳性结果样本。另外3份样品，本试验进一步对样品的核酸进行纯化并提高其浓度后，再采用英国cefaswweymouth实验室建立的即时聚合酶连锁反应检测方法进行检测，结果显示这3份样品也是阳性结果样本。可见，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法的检测灵敏度优于文献的检测方法。

本试验例进一步地对本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法进行检测灵敏度分析。先利用紫外分光光度计测定阳性dna的浓度和纯度，根据测定的浓度计算拷贝数。再以depc水将dna进行10倍序列稀释，稀释成2.5×10⁸拷贝至2.5×100拷贝，作为dna标准品以测试灵敏度，并将前述序列稀释后的dna标准品以本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法进行检测，详细的检测步骤如前所述，在此不再赘述。

请参照图4，为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒的检测灵敏度分析结果图，其中由左至右的曲线依序为2.5×10⁸拷贝、2.5×10⁷拷贝、2.5×10⁶拷贝、2.5×10⁵拷贝、2.5×10⁴拷贝、2.5×10³拷贝、2.5×10²拷贝、2.5×10¹拷贝的检测曲线，而2.5×100拷贝没有扩增曲线。结果显示，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法对鲤浮肿病毒的检测灵敏度高达25个拷贝。

此外，本试验例进一步对本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法进行检测特异性分析，所使用的待测样本包含鲤浮肿病毒(cev)、金鱼造血器官坏死病病毒(gfhnv)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、草鱼呼肠孤病毒(gchv)、鲤疱疹病毒3型(cyhv-3)、鲤疱疹病毒2型(cyhv-2)、鲤疱疹病毒1型(cyhv-1)、流行性造血器官坏死病毒(ehnv)、鳗鲡疱疹病毒(anghv-1)、斑点叉尾鮰病毒(ccv)、传染性造血器官坏死病毒(ihnv)、病毒性败血病病毒(vhsv)的核酸，以本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法进行检测，详细的检测步骤如前所述，在此不再赘述。需要说明的是，若待测样本为rna样本，在检测特异性分析中，需要在反应液中额外加入16u的反转录酶，并在40个循环的反应的前，预先于42℃反应30分钟进行反转录，其余检测步骤相同。

请参照图5，为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒的检测特异性分析结果图。结果显示，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法只对鲤浮肿病毒有特异性扩增，而其它供试毒株则未见扩增曲线，显示本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法具有良好的特异性。

2.隔绝恒温式聚合酶连锁反应

若以检测鲤浮肿病毒的试剂盒100进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应以检测鲤浮肿病毒为例，先以100μl的第二缓冲溶液溶解阳性对照组核酸干粉，以获得浓度为4×10^-5ng/μl的阳性对照，并将回溶后的阳性对照保存于4℃备用。再打开预混试剂包，并根据待测样本数取出对应量的预混试剂管，而预混试剂管中冻干颗粒回溶方式如下列步骤。打开管盖，每一管预混试剂管加入50μl的第一缓冲溶液回溶冻干颗粒，即获得隔绝恒温式聚合酶连锁反应混合液，将溶液混合后移至隔绝恒温式聚合酶连锁反应管中，以隔绝恒温式聚合酶连锁反应装置进行等温扩增。反应条件为反转录42℃反应10分钟，底部加热95℃、30分钟即可得的反应结果。

为了了解本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行隔热同温聚合酶连锁反应扩增80bp的聚合酶连锁反应产物的稳定性，将阳性对照稀释成拷贝数目为100作为阳性对照组，接着以对本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法进行检测分析，隔绝恒温式聚合酶连锁反应产物另以胶体电泳分离，以确保本发明的精确性。

请参照图6和表一，图6为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应的胶体电泳分析图，其中m为核酸的分子量标记，n为不含有靶标基因核酸的阴性对照组。表一为本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应的萤光讯号分析结果。

表一、隔绝恒温式聚合酶连锁反应的萤光分析结果

由图6的结果显示，在拷贝数目为100的阳性对照组，利用本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，即序列标记编号1所示的正向引物、如序列标记编号2所示的反向引物，以及序列标记编号3所示的萤光探针，于3个独立试验管中皆能稳定扩增出大小为80bp的聚合酶连锁反应产物。于表一的萤光讯号分析中，将进行iipcr后的520nm讯号值，除以进行iipcr前的520nm讯号值可得一信噪比(signal-to-noiseratio)，当信噪比超过反应器预设的阈值时，判读为具有萤光讯号(以+表示)。阳性对照组皆于波长520nm可检测到萤光讯号，而未加模板的阴性组则无萤光讯号。结果显示，无论以萤光检测或是胶体电泳分析反应结果，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒，皆能检验待测样本中是否具有鲤浮肿病毒。

上述结果可证明本发明的检测鲤浮肿病毒病的试剂盒在进行隔绝恒温式聚合酶连锁反应时，其专一性及灵敏性皆较比较例的引物对高出许多。

综上所述，本发明的检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法能够灵敏、特异性好、快速且操作简单方便的对鲤浮肿病毒进行检测。检测鲤浮肿病毒的试剂盒不仅能够特异、灵敏的对鲤浮肿病毒进行检测，而且检测鲤浮肿病毒的试剂盒若搭配轻便、易携带，结合可携式的萤光核酸分析仪，例如pockit智慧型手提式核酸分析仪(金瑞鸿捷)，在池塘边就可以对鲤浮肿病毒进行现场检测，为鲤浮肿病毒的快速检测和防控提供了有效的科学手段和重要依据，对保障我国锦鲤等观赏鱼进出口贸易以及国内鲤科鱼类生产养殖安全具有重要意义。

本发明已通过实施方式进行了上述记载，但是，其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，能够进行各种的更动与修饰，因此本发明的保护范围应当以所附的权利要求书所界定的范围为准。

序列表（sequencelisting）

<110>深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心

金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司

<120>检测鲤浮肿病毒的试剂盒及其检验方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<223>引物(primer),扩增鲤浮肿病毒的正向引物

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<223>引物(primer),萤光探针

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<213>鲤浮肿病毒(carpedemavirus）

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<222>

<223>cds,扩增的鲤浮肿病毒去氧核醣核酸片段

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gagaatgaaccgaatcaaca80