4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术：

癌症的诊断和治疗是当前研究最活跃的领域之一，设计、制备诊疗一体化药物被视为癌症诊疗的新策略。结合化学、生物、药学、医学和成像等领域的优势，肿瘤诊疗一体化技术应运而生。该技术主要通过将抗肿瘤药物和成像试剂集成一体，一方面可以利用肿瘤成像技术便捷、快速地诊断肿瘤，另一方面还可使该药物发挥抗肿瘤功效，从而实现诊断和治疗的有机结合。

研究表明，1,8-萘酰亚胺衍生物具有重要的抗肿瘤活性，其衍生物氨萘菲特(amonafide)和米托萘胺(mitonafide)已进入ii期临床试验阶段。此外，由于其结构上具有良好的推-拉电子效应，可产生良好的荧光性能，具有荧光成像的可能性。因此，我们期望基于1,8-萘酰亚胺的结构能得到诊疗一体化的新型萘酰亚胺类抗肿瘤化合物。目前尚未见有在4位上引入功能性基团二硫代甲酸哌嗪制备4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物的公开报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一类结构新颖且具有较好的生物活性和荧光成像性能的4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物及其制备方法和应用。

本发明所述的4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物具有如下述式(i)所示结构：

其中，r为n,n-二甲基乙基、羟乙基、n-甲基乙基或对氯苄基。

本发明所述4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物按下述路线进行制备(r如前所述)：

具体的制备方法主要包括以下步骤：

1)取1-二硫代甲酸哌嗪(在本申请中也称化合物1)和4-溴-1,8-萘酐(在本申请中也称ba)置于有机溶剂中，于加热条件下进行反应，反应物冷却，收集沉淀，得到中间产物(在本申请中也称化合物2)；所述中间产物的结构如下式所示：

2)取中间产物和式(ii)所示化合物置于有机溶剂中，于加热条件下进行反应，反应物冷却，收集沉淀，即得到目标化合物(在本申请中对应于3a-3d共4个化合物)；

r-nh2(ii)；

其中，r为n,n-二甲基乙基、羟乙基、n-甲基乙基或对氯苄基。

本发明所述的制备方法中，所述的有机溶剂为醇类溶剂和/或非质子性溶剂，其中，所述的醇类溶剂具体可以是选自甲醇、乙醇、丙醇和正丁醇中的一种或两种以上的组合；所述的非质子性溶剂具体可以是选自乙二醇甲醚、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、甲苯、四氯化碳和丙酮中的一种或两种以上的组合。所述有机溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，以1mmol的3-硝基-4-溴-1,8-萘酐为基准，所有反应原料用25-50ml的有机溶剂来溶解。当有机溶剂的加入量较大时，反应完全后优选先回收部分有机溶剂后(通常是除去占加入量40-50％的有机溶剂)再将反应物冷却。

本发明所述制备方法的步骤1)中，以薄层层析跟踪检测缩合反应是否完全。反应优选在≤130℃条件下进行，进一步优选在60-130℃条件下进行，更优选在80-130℃条件下进行。当反应在80-130℃条件下进行时，反应至完全需要6-8h的时间。由步骤1)制得的是中间产物的粗品，为了进一步减少引入到步骤2)中的杂质，优选是将步骤1)所得中间产物进行纯化后再用于步骤2)所述的操作中。所述的纯化可以是现有技术中常规的纯化操作，本申请中，优选是将中间产物用溶剂进行重结晶后再用于步骤2)的操作中。所述用于重结晶的溶剂与合成方法中用来合成得到中间产物的有机溶剂相同，优选为甲醇或乙醇。

本发明所述制备方法的步骤2)中，以薄层层析跟踪检测缩合反应是否完全。反应优选在≤100℃条件下进行，进一步优选在50-100℃条件下进行，更优选在60-80℃条件下进行。当反应在60-80℃条件下进行时，反应至完全需要3-6h的时间。

上述合成方法制备得到的是目标化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式(i)所示化合物的纯度，具体可以采用重结晶或硅胶柱层析来进行纯化。当采用重结晶进行纯化时，用于重结晶的溶剂与合成方法中用来合成得到目标化合物的有机溶剂相同，优选为甲醇或乙醇。当采用柱层析进行纯化时，具体是将步骤2)所得的目标化合物上硅胶柱层析，用由体积比为1-50：1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂洗脱(优选用由体积比为15：1的二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂洗脱)，洗脱液蒸除溶剂，得到纯化后的目标化合物。

还包括对所得目标化合物进行纯化的步骤。

本发明还包括上述式(i)化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明进一步包括一种药物组合物，含有治疗上有效剂量的上述式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了一类结构新颖的4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物，其制备周期短，后处理简单，成本低，且得到的衍生物纯度高，质量稳定；申请人的体外试验结果表明，通过在-1,8-萘酰亚胺的4位上引入功能性基团二硫代甲酸哌嗪使所得4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物具有较好的生物活性，其中某些衍生物具有极为显著的生物活性，有望开发成抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明实施例5制得的化合物3b的单晶结构图；

图2为本发明实验例2中化合物3a在人膀胱癌细胞株t24中的荧光成像图，其中(a)为化合物3a的自发荧光(绿色荧光)成像图，(b)为细胞核染料dapi的荧光成像图(蓝色荧光)，(c)为(a)和(b)两图叠加后的显色效果图(蓝、绿色荧光均显示)；

图3本发明实验例2中化合物3d在人膀胱癌细胞株t24中的荧光成像图，其中(a)为化合物3d的自发荧光(绿色荧光)成像图，(b)为细胞核染料dapi的荧光成像图(蓝色荧光)，(c)为(a)和(b)两图叠加后的显色效果图(蓝、绿色荧光均显示)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中，ba表示-4-溴-1,8-萘酐，化合物1表示1-二硫代甲酸哌嗪，化合物2表示中间产物(即4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酐)。

实施例1：化合物2的合成

称取5.0g(18.2mmol)ba于100毫升圆底烧瓶中，再加入13.5g(53.7mmol)化合物1，加入乙二醇甲醚50ml，120℃回流7h，趁热除去部分溶剂，静置冷却过夜，抽滤，收集滤饼，用乙醇重结晶，得到4.45g黄色晶体，收率57.5％。

对所得黄色晶体进行结构表征，数据如下：¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.59(d,j＝8.5hz,1h),8.50(d,j＝7.2hz,1h),8.40(d,j＝8.1hz,1h),7.85(t,j＝7.9hz,1h),7.44–7.26(m,6h),4.58(s,4h),4.24(s,2h),3.44(s,4h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ195.38,161.16,160.33,155.50,136.15,134.03,132.58,131.97,131.69,129.28,128.53,127.45,126.42,125.05,119.36,115.44,111.81,51.60,40.82.msm/z:387[m+h]⁺.

因此，可确定本实施例所得黄色晶体为化合物2，即4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酐，其结构式如下式所示：

实施例2：化合物2的合成

称取2.5g(9.1mmol)ba于50ml圆底烧瓶中，再加入1.72g(9mmol)化合物1，加入dmf50ml，100℃回流6h，趁热除去部分溶剂，静置冷却过夜，抽滤，收集滤饼，得到1.01g黄色粉末，收率13.1％。

对所得黄色晶体进行结构表征，数据如下：

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.59(d,j＝8.5hz,1h),8.50(d,j＝7.2hz,1h),8.40(d,j＝8.1hz,1h),7.85(t,j＝7.9hz,1h),7.44–7.26(m,6h),4.58(s,4h),4.24(s,2h),3.44(s,4h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ195.38,161.16,160.33,155.50,136.15,134.03,132.58,131.97,131.69,129.28,128.53,127.45,126.42,125.05,119.36,115.44,111.81,51.60,40.82.msm/z:387[m+h]⁺.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末为化合物2，即4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酐。

实施例3：化合物2的合成

称取2.5g(9mmol)nba于50ml圆底烧瓶中，再加入1.72g(9mmol)1，加入二甲基亚砜和n,n-二甲基甲酰胺按1：1的体积比组成的混合溶剂50ml，80℃回流6h，趁热除去部分溶剂后，静置冷却过夜，收集滤饼，得到1.12g黄色粉末，收率14.5％。

对所得黄色晶体进行结构表征，数据如下：

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.59(d,j＝8.5hz,1h),8.50(d,j＝7.2hz,1h),8.40(d,j＝8.1hz,1h),7.85(t,j＝7.9hz,1h),7.44–7.26(m,6h),4.58(s,4h),4.24(s,2h),3.44(s,4h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ195.38,161.16,160.33,155.50,136.15,134.03,132.58,131.97,131.69,129.28,128.53,127.45,126.42,125.05,119.36,115.44,111.81,51.60,40.82.msm/z:387[m+h]⁺.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末为化合物2，即4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酐。

实施例4：4-二硫代甲酸哌嗪-n-(n,n-二甲基)乙基-1,8-萘酰亚胺(化合物3a)的合成

称取0.67g化合物2(1.5mmol)于圆底烧瓶中，再加入0.132g(1.5mmol)n,n-二甲基乙二胺，再加入50ml乙醇溶解，80℃回流3h，薄层色谱监测反应，反应结束后，冷却，过滤，得到黄色粉末3a0.640g,yield,76.8％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.59(d,j＝7.3hz,1h),8.52(d,j＝8.0hz,1h),8.41(d,j＝8.4hz,1h),7.73(t,j＝7.9hz,1h),7.40(d,j＝7.6hz,2h),7.33(t,j＝7.4hz,2h),7.28(d,j＝7.2hz,1h),7.22(d,j＝8.0hz,1h),4.60(s,4h,2ch2),4.31(t,j＝7.0hz,4h,2ch2),3.39–3.23(m,4h,2ch2),2.64(t,j＝7.0hz,2h,ch2),2.35(s,6h,2ch3).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ197.77(c＝s),164.42,163.95,154.59,135.76,132.45,131.46,129.99,129.74,129.52,128.78,127.79,126.35,123.56,118.04,115.59,57.13,52.54,45.86,42.41,38.18.msm/z:553[m+cl]^-.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末3a为4-二硫代甲酸哌嗪-n-(n,n-二甲基)乙基-1,8-萘酰亚胺，其结构式如下式所示：

实施例5：4-二硫代甲酸哌嗪-n-羟乙基-1,8-萘酰亚胺(化合物3b)的合成

称取0.67g化合物2(1.5mmol)于圆底烧瓶中，再加入0.109g(1.5mmol)乙醇胺，再加入50ml甲醇溶解，70℃回流6h，薄层色谱监测反应，反应结束后，冷却，过滤，得到黄色粉末3b0.572g，yield,71.7％；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.60(d,j＝7.3hz,1h),8.52(d,j＝8.0hz,1h),8.41(d,j＝8.4hz,1h),7.74(t,j＝7.9hz,1h),7.40(d,j＝7.3hz,2h),7.33(t,j＝7.2hz,2h),7.29(d,j＝7.1hz,1h),7.22(d,j＝8.0hz,1h),4.61(s,6h),4.19–4.13(m,2h,ch2),3.34(t,j＝4.4hz,4h,2ch2),1.74–1.66(m,2h,ch2),1.51–1.37(m,2h,ch2),0.97(t,j＝7.3hz,3h,ch3).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ197.77(c＝s),164.39,163.93,154.50,135.77,132.35,131.37,129.91,129.64,129.52,128.78,127.79,126.36,123.64,118.15,115.60,52.55,42.42,40.28,30.37,20.51,13.97.msm/z:538[m+cl]^-.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末3b为4-二硫代甲酸哌嗪-n-羟乙基-1,8-萘酰亚胺，其结构式如下式所示：

为了更进一步确定化合物3b的结构，在二氯甲烷和甲醇的混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为2：1)培养单晶后进行了x-ray衍射，单晶结构图如图1所示。对比可知，化合物3b的单晶结构与3b的结构吻合。

实施例6：4-二硫代甲酸哌嗪-n-对氯苄基-1,8-萘酰亚胺(化合物3c)的合成

称取0.67g化合物2(1.5mmol)于圆底烧瓶中，再加入0.211g(1.50mmol)对氯苄胺，再加入50ml乙醇溶解，80℃回流4h，薄层色谱监测反应，反应结束后，冷却，过滤，得到黄色粉末3c0.67g，yield,73.3％；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.61(d,j＝7.1hz,1h),8.53(d,j＝8.0hz,1h),8.42(d,j＝8.3hz,1h),7.74(t,j＝7.9hz,1h),7.48(d,j＝8.4hz,2h),7.40(d,j＝7.0hz,2h),7.33(t,j＝7.2hz,2h),7.29(d,j＝7.0hz,1h),7.26–7.20(m,3h),5.31(s,2h,ch2),4.61(s,6h,3ch2),3.34(s,4h,2ch2).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ197.83(c＝s),164.39,163.91,154.86,136.02,135.76,133.42,132.77,131.74,130.60,130.03,130.01,129.53,128.80,128.68,127.82,126.41,126.38,123.41,117.79,115.64,52.55,42.96,42.44.msm/z:606[m+cl]^-.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末3c为4-二硫代甲酸哌嗪-n-对氯苄基-1,8-萘酰亚胺，其结构式如下式所示：

实施例7：4-二硫代甲酸哌嗪-n-(4,5-二羟基基)苯乙基-1,8-萘酰亚胺(化合物3d)的合成

称取0.67g化合物2(1.39mmol)于圆底烧瓶中，再加入0.132g(1.50mmol)n-甲基丙胺，再加入50ml乙醇溶解，60℃回流5h，薄层色谱监测反应，反应结束后，冷却，得到黄色粉末3d0.515g，yield,61.8％；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.58(d,j＝7.3hz,1h),8.50(d,j＝8.0hz,1h),8.41(d,j＝8.4hz,1h),7.76–7.69(m,1h),7.39(d,j＝7.2hz,2h),7.32(t,j＝7.2hz,2h),7.27(d,j＝7.1hz,1h),7.21(d,j＝8.0hz,1h),4.59(s,4h),4.22(t,j＝7.1hz,4h),3.33(t,j＝4.6hz,4h),2.65(t,j＝6.9hz,2h),2.42(s,3h,ch3),1.96–1.89(m,2h),1.76(s,1h,nh).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ197.72(c＝s),164.40,163.94,154.57,135.73,132.42,131.41,129.88,129.74,129.48,128.74,127.76,126.33,126.31,123.46,117.91,115.56,52.51,49.30,42.37,38.29,36.46,28.32.msm/z:553[m+cl]^-.

因此，可确定本实施例所得黄色粉末3d为4-二硫代甲酸哌嗪-n-(4,5-二羟基基)苯乙基-1,8-萘酰亚胺，其结构式如下式所示：

实验例1：为说明本发明所述4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物的抗肿瘤作用，申请人对按上述实施例4-7所述方法制得的目标化合物均进行了的抗肿瘤活性实验(以米托萘胺和氨萘菲特为参比)。

采用mtt法测试化合物的体外抗肿瘤活性。取处于对数生长期的细胞，每孔180μl(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5％co2充分湿化条件下培养24h。待细胞贴壁后，按每孔20μl的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。继续培养48h后，每孔加入10μlmtt试剂(浓度为5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μldmso，轻微震荡反应5～8min，使结晶颗粒充分溶解。空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值(值)，计算细胞增殖抑制率，对初筛抗肿瘤效果好的受试化合物，继续用5个浓度梯度继续做相应细胞株的ic50值，所有实验均重复3次后取平均值。实验结果详见下表1。

表1.目标化合物对不同肿瘤细胞株的半抑制率浓度(ic50，μm)

由表1中数据可知：化合物3a-3d均对人胃癌细胞mgc-803、人肝癌细胞hepg2、人卵巢癌细胞skov-3和人膀胱癌细胞t24展示了明显的抑制活性，其中化合物3a和3d的对这四株人肿瘤细胞株的抑制活性均优于氨萘菲特，半抑制率浓度(ic50)分别为5.23±0.66μm、3.60±0.37μm、1.43±0.13μm、3.03±0.48μm和3.04±0.27μm、1.54±0.36μm、1.07±0.15μm、0.59±0.06μm，且：3a对mgc-803的抑制率甚至优于米托萘胺；3d对mgc-803和t24的抑制率甚至优于米托萘胺。

以上结果表明，通过将二硫代甲酸哌嗪引入1,8-萘酰亚胺结构制备出新型的4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺抗肿瘤化合物是可行的，有望筛选出高效低毒的新型抗肿瘤化合物，与米托萘胺相比，某些4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物(如化合物3a和3d)的活性更高效。

实验例2：为说明本发明所述4-二硫代甲酸哌嗪-1,8-萘酰亚胺衍生物的荧光成像性能，申请人对按上述实施例4和实施例7所述方法制得的化合物3a和3d按现有常规方法进行荧光成像实验。具体如下：

本实验选用人膀胱癌细胞株t24。所用细胞株培养在含10wt％小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的dmem培养液内，置37℃含体积浓度5％co2孵箱中培养。所用的药物为化合物3a和化合物3d，分别按上述实施例4和实施例7所述方法制得，纯度≥95％。

实验时以dmso为溶剂配2mm的化合物3a原药，用培养液稀释到一定浓度之后加入6孔板中，化合物3a(1μm)处理细胞24h，利用4％的多聚甲醛室温下固定细胞30min后，用预冷的pbs缓冲液洗净固定液，之后在每个六孔板加入5μg/ml的细胞核染料dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，37℃培养箱孵育20min，再用预冷的pbs缓冲液洗三遍染色后的细胞。测定结果如图2所示，其中(a)为化合物3a的自发荧光(绿色荧光)成像图，(b)为细胞核染料dapi的荧光成像图(蓝色荧光)，(c)为(a)和(b)两图叠加后的显色效果图(蓝、绿色荧光均显示)。

同样以dmso为溶剂配2mm的化合物3d原药，用培养液稀释到一定浓度之后加入6孔板中，化合物3d(1μm)处理细胞24h，利用4％的多聚甲醛室温下固定细胞30min后，用预冷的pbs缓冲液洗净固定液，之后在每个六孔板加入5μg/ml的细胞核染料dapi，37℃培养箱孵育20min，再用预冷的pbs缓冲液洗三遍染色后的细胞。测定结果如图3所示，其中(a)为化合物3d的自发荧光(绿色荧光)成像图，(b)为细胞核染料dapi的荧光成像图(蓝色荧光)，(c)为(a)和(b)两图叠加后的显色效果图(蓝、绿色荧光均显示)。

上述试验说明化合物3a和3d具有良好的荧光成像性能，可以染色人膀胱癌细胞株t24。