本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种马来酸水合酶突变体、及其用于酶法催化马来酸水合反应生产d-苹果酸的用途。
背景技术：
d-苹果酸，cas636-61-3，分子量134，又称2-羟基丁二酸，是自然界中稀有的有机酸，其在医药工业中有广泛的用途，d-苹果酸作为手性前体主要用于手性药物的合成，可用作原料合成抗生素、抗病毒药物、抗组胺药物等。d-苹果酸的合成方法，一般可利用不对称合成法、消旋体物理拆分法和生物法进行合成制备。已有的生物法，主要是天然微生物拆分法和全细胞转化法，两种方法都存在所用微生物难以高密度发酵、底物转化率低和产品光学纯度低等问题，造成工业化生产成本较高，无法满足市场需求。
众所周知，富马酸(fumaricacid)和马来酸(maleicacid)都是丁烯二酸，两者的区别在于立体结构不一样，富马酸是反丁烯二酸，呈反式结构；马来酸是顺丁烯二酸，呈顺式结构，两者的酸性是不同的。马来酸又称为失水苹果酸。
研究发现，有些富马酸水合酶(fumc)也能够催化马来酸进行水合反应来产生d-苹果酸，受此启发，我们对于各种来源的富马酸水合酶进行了筛选和比较，发现光合细菌荚膜红假单孢菌(rhodopseudomonascapsulata)来源的富马酸水合酶fumc具有上述催化功能，但催化效率不高，判断为酶活力低造成的，因此有必要对该酶进行改造，以期获得高酶活力的突变体。
技术实现要素：
为了探索酶催化法制备d-苹果酸的工业化可行性，本发明利用基因工程技术来对一种光合细菌荚膜红假单孢菌(rhodopseudomonascapsulata)来源的富马酸水合酶fumc基因(氨基酸序列参见uniprotkb-a0a507zeg8)进行定向进化，筛选高酶活性的突变体，从而有利于实现酶法生产d-苹果酸的工业化。
为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对野生型富马酸水合酶fumc或称野生型马来酸水合酶(seqidno:1)进行改造，获得高酶活力的马来酸水合酶突变体，以便高效地将马来酸催化生成d-苹果酸。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种高酶活力的马来酸水合酶突变体。
本发明的第二个目的在于提供编码上述马来酸水合酶突变体的基因。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
本发明的第五个目的在于提供上述突变体或微生物在生产中的用途。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种马来酸水合酶突变体，其氨基酸序列为seqidno:3，其为seqidno:1第78位的t替换为h、第138位的q替换为p、第150位的v替换为a、第312位的p替换为s的突变体，氨基酸序列为：
mtatrtetdsfgplevpadkywgaqtqrsiqnfpigwerqpkpiiralgvikkaaalvnkaqgdldpaladaiaaaaneviegkfddnfplvvwqtgsgtqsnmnanevisnraiemlggvmgskkpvhpndhvnmgpssndtfptamhaaiachardvlipgleklskalwakseefkdiikigrthtqdatpltlgqefsgyatqvdrgiervklalphiyelaqggtavgtglntrvgwdtriaaqiaeitglpfvtapnkfealaahdamvffsgalktiaaslfkiandmrllgsgprsglgelilsenepgssimpgkvnptqaealtmvcahvmgndaaigfagsqghfelnvynpmmsynvlqsmqllgdsasaftdnmvvgtqantaridklmkeslmlvtalaptigydaatkvaktahkngttlreeaialgyvdgetfdrvvrpedmispkg(seqidno:5)；
一种编码上述马来酸水合酶突变体的基因。
优选地，编码上述马来酸水合酶突变体seqidno:3的基因可以是下述核苷酸序列：
atgaccgcgacccgcaccgaaaccgacagctttggcccgctcgaagttccagccgataaatattggggcgcgcagacccagcgcagcattcagaacttcccaatcggttgggagcgccagccgaaaccaatcatccgcgcgctgggcgtgatcaaaaaagccgccgcgctcgtgaataaagcgcaaggcgatctggatccagcgctggccgatgccattgccgccgccgcgaacgaagttatcgaaggcaagttcgacgacaacttcccgctggtggtttggcaaaccggcagcggcacccaaagcaacatgaacgcgaacgaagtgatcagcaaccgcgccatcgagatgctcggtggtgtgatgggcagcaagaagccggttcatccgaatgatcacgtgaacatgggcccgagcagcaacgatacctttccaaccgccatgcatgcggcgatcgcgtgccatgcgcgcgatgttctgatcccgggtctggagaaactgagcaaagcgctgtgggccaaaagcgaagaattcaaagatatcatcaagatcggccgcacgcacacccaagatgccaccccactgacgctgggccaagaattcagtggctatgccacccaagttgaccgcggcattgaacgcgttaaactggcgctgccgcatatctacgaactggcgcaaggtggcaccgccgttggcaccggtctgaatacccgcgttggttgggatacgcgcatcgcggcgcaaatcgcggaaatcaccggtctgccgtttgttaccgcgccgaacaaattcgaagcgctggcggcccatgatgcgatggttttcttcagcggtgcgctgaaaaccatcgccgccagcctcttcaagatcgccaacgatatgcgtctgctgggtagtggtccacgcagcggtctgggtgagctgattctgtcggagaatgagccgggcagcagcattatgccgggcaaagttaatccgacgcaagccgaagcgctgacgatggtttgcgcccacgttatgggcaatgatgccgccattggtttcgccggtagccaaggccacttcgagctgaacgtgtacaacccgatgatgagctacaacgtgctgcaaagcatgcagctgctgggtgacagcgccagcgccttcaccgataacatggttgttggcacccaagccaataccgcgcgtatcgacaagctcatgaaggagagtctgatgctggttacggcgctggccccaaccatcggttacgatgcggccacgaaagtggcgaaaacggcgcacaaaaacggtaccacgctgcgcgaagaagcgatcgcgctgggttacgttgatggcgagaccttcgatcgcgtggtgcgcccagaagacatgatcagcccaaaaggctaa(seqidno:4)。
一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是psh系列，但并不受限于此。
一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述马来酸水合酶突变体。
优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。
上述马来酸水合酶突变体或者上述微生物可以用于生产d-苹果酸。
在生产中，以为马来酸底物原料，用上述马来酸水合酶突变体或者微生物作为催化剂来催化水合反应，得到产物d-苹果酸。
作为一种可选的实施方式，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，作为水合反应的催化剂。
生产d-苹果酸可采用常规的工艺条件，比如，反应温度选择20-40℃，例如25-35℃。
反应体系可以为ph7.0-8.0，例如ph7.5。
相较野生型马来酸水合酶seqidno:1，本发明构建的马来酸水合酶突变体seqidno:3催化马来酸进行水合反应的酶活性有明显提高。当采用表达该马来酸水合酶突变体的全细胞催化100g/l马来酸底物进行水合反应时，产物d-苹果酸的光学纯度超过99％(ee值)，具有工业化开发应用前景
具体实施方式
本发明构建的马来酸水合酶突变体seqidno:3是光合细菌荚膜红假单孢菌(rhodopseudomonascapsulata)来源的野生型富马酸水合酶(简写为fumc)seqidno:1的突变体，是seqidno:1序列中多个氨基酸发生替换(t78h、q138p、v150a、p312s)后形成的新蛋白质。其中seqidno:1的编码基因是序列表中的序列seqidno:2。
由于富马酸水合酶seqidno:1具有催化马来酸通过一步水合反应生成d-苹果酸的功能，本发明中也可将该富马酸水合酶(fumc)称为马来酸水合酶。相应地，也将该富马酸水合酶seqidno:1的突变体称作马来酸水合酶突变体。本领域技术人员能够很容易理解，这种术语表述的统一是出于酶催化功能的考虑，并不会误认为所有富马酸水合酶都可称为马来酸水合酶。
因此在本发明中，术语“野生(型)酶”、“野生酶”、“野生(型)马来酸水合酶”、“野生(型)富马酸水合酶”表示相同的意义，都是指光合细菌荚膜红假单孢菌(rhodopseudomonascapsulata)来源的野生型富马酸水合酶fumc，其氨基酸序列为seqidno:1。
为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：
表1氨基酸中英文对照及缩写
为了获得酶性能更高的马来酸水合酶，本发明对seqidno:1的基因序列seqidno:2进行点突变。通过易错pcr技术获得一系列突变体，发现有些位点的氨基酸的替换或缺失会导致突变体的酶活力的显著变化。这些位点包括第78位的thr、第138位的gln、第150位的val、第219位的leu、第312位的pro、第357位的glu。通过实验发现第78位的thr替换为asn(t78n)、第138位的gln替换为pro(q138p)、第150位的val替换为ala(v150a)、第312位的pro替换为ser(p312s)所形成的突变体seqidno:3的酶活性相比野生型酶seqidno:1有明显提高，提高了120多倍。另外，q138p、v150a、p312s、e357n突变体的酶活性相比野生型酶seqidno:1也有明显提高，提高了近80倍。
本发明的马来酸水合酶突变体的氨基酸数量只有464个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。
当作为生物催化剂用于生产时，本发明的突变体可以呈现分离酶的形式或者菌体的形式。所述分离酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述突变体seqidno:3的微生物菌体细胞作为酶催化反应的生物催化剂。菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，ph7.2。(lb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
tb培养基：24g/l酵母提取物、12g/l胰蛋白胨、16.43g/lk2hpo4.3h2o、2.31g/lkh2po4、5g/l甘油，ph7.0-7.5。(tb固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
底物马来酸和产物d-苹果酸的hplc测定条件：
使用安捷伦高效液相色谱仪1260infinityii进行检测，色谱柱为手性色谱柱chiralpak-ic(4.6x250mm，5um)，以d-苹果酸和l-苹果酸标准品作为参比物，流动相正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.1，流速为0.5ml/min，进样量为100ul，检测波长210nm，柱温为35℃。
旋光仪型号：rudolphautopolv。
实施例1野生型马来酸水合酶表达菌株的构建
1.1对于来源于rhodopseudomonascapsulata的富马酸水合酶fumc，根据报道的氨基酸序列(uniprotkb-a0a507zeg8)，通过大肠杆菌密码子频率优化，委托苏州金维智生物技术有限公司进行全基因序列合成序列seqidno:1，亚克隆到psh质粒(浙江华睿生物技术有限公司)，得到表达野生型酶seqidno:1的表达载体psh-fumc。
正向引物fumc-f：5’-catatgaccgcgacccgcaccga-3’，
反向引物fumc-r：5’-ctcgagttagccttttgggctgatca-3’。
pcr扩增约1.4kb片段，pcr反应体系包括：正向引物、反向引物各0.3μm，模板50ng，1xkodneoplusbuffer，0.2mmdntp,1.5mmmgso4，kodneoplus1u，补双蒸水至总体系50μl。pcr条件：94℃，2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s，重复30循环；68℃10min。
pcr反应结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收片段。质粒载体psh或fumc片段分别用ndei和xhoi进行双酶切处理，酶切体系：质粒37ul(或片段37μl)，10xbuffer5μl，ndei1.5μl，xhoi1.5μl。酶切结束同样使用胶回收试剂盒回收片段。其中pcr用酶kodneoplus购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，胶回收试剂盒omegagelextractionkitd2500购自广州飞扬生物工程有限公司。
1.2通过电转化将重组质粒psh-fumc转化入表达宿主比如大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(invitrogen公司)，得到表达野生型马来酸水合酶的重组大肠杆菌。也可以将重组质粒psh-fumc转化入其他宿主比如毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等中来表达野生型马来酸水合酶。
实施例2通过易错pcr法构建fumc随机突变点库和筛选
2.1易错pcr法构建fumc随机突变点库构建
以序列seqidno:1为模板，应用易错pcr技术构建随机突变体库。正向引物fumc-nde1-f为5’-atgaccgcgacccgcaccga-3’，反向引物fumc-xho1-r为5’-ctcgagttagccttttgggctgatca-3’。
50μl易错pcr反应体系包括：50ng质粒模板psh-fumc，30pmol一对引物fumc-nde1-f和fumc-xho1-r，1xtaqbuffer，0.2mmdgtp，0.2mmdatp，1mmdctp，1mmdttp，7mmmgcl2，(0mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm)mncl2，2.5个单位的taq酶(fermentas)。
pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。
胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用kod-plusdna聚合酶做megaprimerpcr：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。dpni消化质粒模板，电转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子，接种到含700μllb培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/ml卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mmiptg后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μl含50mmtris-hcl(ph7.5)，重悬菌体，用于马来酸水合酶活力测定。
酶活测定反应体系包含：2％v/v菌浓度的全菌或破壁粗酶液，100mm马来酸，50mmtris-hcl，调ph到7.5，25℃下反应。
酶活单位定义：在ph7.5、25℃温度的条件下，每分钟催化底物马来酸产生1微摩尔(μmol)d-苹果酸所需要的酶量定义为1个单位(u)。
2.3高酶活突变体的测定和筛选
底物反应液：加入100mm的马来酸，50mmtris-hcl调节ph。
终止反应液：1m的naoh溶液。
将上述步骤2.2中的80μl酶液加入80μl底物反应液，在25℃的条件下反应2h，加入40μl终止反应液，然后5000rpm离心10min。离心取上清，用hplc检测d-苹果酸产量，并计算酶活力。
从随机突变库中，通过对约1000多个突变体克隆筛选，经测序发现，发现有些位点的氨基酸的替换会导致突变体的酶活力的显著变化，这些位点包括第78位的thr、第138位的gln、第150位的val、第219位的leu、第312位的pro、第357位的glu。部分发生了正向突变的突变体测序结果显示于表2中。
表2、多种fumc突变体的催化马来酸转化酶活力
*酶比活力：以野生酶的发酵活力(u/ml)与菌体浓度od(od/ml)的比值为100％。
表2的实验结果显示，t78n、q138p、v150a、p312s突变所形成的突变体fumc-1480(即seqidno:3)的酶活性相比野生型酶seqidno:1有明显提高，提高了120多倍。另外，q138p、v150a、p312s、e357n突变体fumc-584的酶活性相比野生型酶seqidno:1也有明显提高，提高了近80倍。
实施例3突变体菌株构建
我们重点研究了突变体fumc-1480，考察其催化马来酸通过一步水合反应来转化成d-苹果酸的情况。为此，将fumc-1480突变基因seqidno:4克隆到psh质粒中，得到表达野生型酶seqidno:4的表达载体psh-fumc-1480。
使用该质粒psh-fumc-1480，可以构建到不同的表达系统中，比如大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等。例如，将质粒psh-fumc-1480转化bl21(de3)感受态细胞中，涂kan+lb平板，37℃培养过夜，挑选10个单菌落，接种到含有lb液体培养基的试管中，37℃培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确，得到工程菌fumc-1480。
实施例4菌株发酵及反应
4.1从工程菌fumc-1480的lb平板上挑选单克隆，接种到5mllb培养基中，37℃培养过液；按1％v/v比例接种到含有100mltb培养基的1000ml摇瓶中，37℃、220rpm培养4-6小时，od600值达到1.2-1.5时，加入0.2mm的iptg诱导；然后降温到25℃继续培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。
4.2采用反应体系200ml，底物马来酸浓度100g/l，加酶量分别为2％、4％、6％、8％v/v菌浓度，控制25℃，200rpm，ph7.5，反应5h，测定d-苹果酸生成量，计算底物转化率，产物ee值。结果见表3。
表3、不同酶量的突变酶fumc-1480催化马来酸获得d-苹果酸
综上所述，相比野生型马来酸水合酶，本发明构建的马来酸水合酶突变体seqidno:3催化马来酸水合反应生成d-苹果酸的酶活力有了明显提高，提高了120多倍，且产物光学纯度(ee值)可超过99％，具有工业化开发和应用前景。
序列表
<110>浙江华睿生物技术有限公司
<120>一种马来酸水合酶突变体及其应用
<130>shpi1910726
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>464
<212>prt
<213>rhodopseudomonascapsulata
<400>1
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