专利名称:凡纳滨对虾est微卫星标记的特异引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA分子遗传标记技术，具体涉及海洋经济动物对虾属凡纳滨对奸vannamei)EST (Express Sequence Tag,表达序列标签)微卫星标记的特异引物及其应用。
背景技术：
凡纳滨对奸{Litopenaeus vannamei )，俗称南美白对虫下 iPenaeus vannamei )，属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对奸科(Penaeidae)、对奸属iPenaeusy Lito~penaeus亚属，是广温广盐性热带虾类，是目前世界上三大养殖对虾(中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾)中单产量最高的虾种，在对虾渔业及养殖业中占有重要地位。1988年7月，凡纳滨对虾由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，1992年8月人工繁殖获得了初步的成功，1994年通过人工育苗获得了小批量的虾苗，1999年深圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进美国SPF凡纳滨对虾种虾和繁育技术，成功地培育出了 SPF凡纳滨对虾苗。至此，凡纳滨对虾在我国被广泛养殖。
近年来，凡纳滨对虾在我国不论是在一般海水、还是低盐度海水以及淡水中养殖，都取得了一定的进展。目前，凡纳滨对虾已是我国养殖对虾的绝对优势品种。2007年，我国凡纳滨对虾养殖产量101万吨，占我国对虾养殖产量的80 %，同年，我国对虾养殖产量126万吨，占世界对虾养殖总产量的37 %。但养殖快速发展而产生的病害使得凡纳滨对虾资源迅速衰减，尤其自90年代虾病暴发以来，凡纳滨对虾养殖业受到重挫。虾病的流行使得对虾抗病品系选育成为必需要解决的问题。目前，国内的渔业遗传改良主要以群体选育为主，但群体选育获得的后代，其个体间亲缘关系不明确，选育过程中不可避免地造成近交和遗传多样性的丢失。因此，品系改良需要用更精确的选育方法来进行。这些方法急需找到一种能够有效鉴别出不同家系的标记，从而清楚选育群体的亲缘关系，了解系谱信息，有效减少近交，且合理高效地利用选育群体。本发明利用生物信息学方法从凡纳滨对虾ESTs数据库搜索EST微卫星，并筛选具有多态的微卫星引物，为利用EST微卫星分子标记技术研究凡纳滨对虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在凡纳滨对虾抗病生长育种中的初步应用，为构建高密度凡纳滨对虾遗传连锁图谱、QTL定位重要经济性状和进行分子标记辅助选育奠定基础。
中国专利公开号CN1233846C(发明名称中国对虾S33微卫星标记的检测技术，公告日2005年12月28日)和中国专利公开号CN1233845C (发明名称中国对虾B683微卫星标记的检测技术，公告日2005年12月28日)公开了中国对虾微卫星标记的检测技术。
另外，中国专利公开号CN101058831 (发明名称太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，
公开日2007年10月24日)公开了一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，包括利用GenBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2飞个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。
近年来，随着对凡纳滨对虾的研究不断地深入，现已有16万多条ESTs序列提交，如何从这些序列中挖掘出有效的信息已成为研究的重点之一。已有报道从这些ESTs序列中克隆出重要的免疫基因，而凡纳滨对虾EST微卫星的建立，必将为构建高密度的遗传连锁图谱、分子辅助育种、定位重要的生长、抗病等经济性状奠定基础。大量的从凡纳滨对虾的EST文库中筛选多态性的微卫星位点的方法至今没有报道。
发明内容
本发明的目的是填补现有技术中凡纳滨对虾EST微卫星标记筛选的空白，提供一种凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物。
一种凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物，其核苷酸序列分别命名为Cz20、 Czll7、Fxl51、Fxl97、Fx4 ；
其中Cz20:F:SEQ ID NO: I, R SEQ ID NO:2 ；
Czll7 F SEQ ID N0:3, R SEQ ID NO:4 ；
Fxl51 F SEQ ID N0:5, R SEQ ID NO:6 ；
Fxl97 F SEQ ID N0:7, R SEQ ID NO:8 ；
Fx4 F SEQ ID N0:9, R SEQ ID NO: 10。
上述凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物筛选凡纳滨对虾EST微卫星标记的方法，包括以下步骤利用数据库中凡纳滨对虾ESTs的序列进行拼接和聚类，然后进行微卫星位点的查找，对于2飞个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；利用凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物进行扩增，对同一模板进行3次重复扩增后，用PIC_6. 0软件评估多态性，选择PIOO. 25的为微卫星
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上述从凡纳滨对虾ESTs序列中筛选凡纳滨对虾微卫星的步骤是从NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)数据库中选择 EST,并以 Litopeimeus vannamei 为关键字进行搜索，将搜索出来的序列按FASTA格式下载下来，然后利用批量序列拼接工具CAP3软件对FASTA格式的ESTs序列进行拼接和聚类，再利用微卫星查找软件SSRhunter对这些拼接和聚类好的ESTs逐一分析，对2飞个碱基重复单元数大于5的微卫星片段进行筛选分离，得到原始 EST 序列 LV_GL_RA09G18f，LV_HC_RA071F01f, LV_HC_RA074D14f, LV_ES_RA17P12f，LV_ES_RAllM06f，采用引物设计软件Primer Primer 5. 0对上述EST序列进行引物设计，分别得到LV_GL_RA09G18f微卫星弓I物Cz20，LV_HC_RA07IR)If微卫星弓I物Cz 117，LV_HC_RA074D14f 微卫星引物 Fxl51，LV_ES_RA17P12f 微卫星引物 Fxl97，LV_ES_RAllM06f微卫星引物Fx4。
上述设计引物的参数为
(I)引物所处位置不应有未确定的序列；
(2)引物既不能离核心序列太近又不能太远，大约1(T60 bp;
(3)引物序列由18 27个核苷酸组成，多为23 bp左右，产物在80 500 bp之间；[0021](4)引物序列富含G/C，G/C含量一般为4(T60 %，G/C规则分布，上下游引物的G/
C含量不能相差太大；
(5)弓I物最好在5 ’和3 ’端含有一个G/C，要注意避免连续A/T超过5个核苷酸；
(6)引物的Tm值应控制在57 68°C之间，如果不行可以考虑控制在45 65°C，两条引物的长度和Tm值不应该差别太大，并且引物之间尽量避免二聚体或发夹结构；
(7)引物之间应该是低互补性或无互补性的、3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
利用凡纳滨对虾微卫星引物进行PCR扩增的加样参数为正反向引物各为0.2 U mol/L, 0. 2 mmol/L dNTP, IXPCR Buffer, 2. 0 mmol/L Mg2+, 0. 6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20 ill。
上述利用EST微卫星标记的特异引物筛选凡纳滨对虾EST微卫星标记的方法中，PCR扩增反应体系各对引物退火温度分别为SEQ ID N0:1 2S55°C，SEQ ID N0:3 4为48。。，SEQ ID NO:5 6 为 55°C，SEQ ID NO: 7 8 为 51°C，SEQ ID NO:9 10 为 50°C。
利用上述凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物检测微卫星多态性的方法，将来源不同的凡纳滨对虾基因组模板进行PCR扩增，其产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker作为分子量标准，检测微卫星的多态性。
上述凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物在凡纳滨对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱的构建、重要经济性状的定位、功能基因的研究、辅助凡纳滨对虾分子遗传育种或养殖中的应用。
本发明具有以下有益效果
(I)本发明特别适合具有大量EST序列的物种，通过对大量EST序列的拼接和聚类，相对以往先查找微卫星序列后进行聚类分析更加科学和节省时间。
(2)本发明可用于凡纳滨对虾群体间遗传标记，系谱认证或遗传图谱的构建等，用途更为广泛。
图I为3个凡纳滨对虾群体的UPGMA系统树，其中ZX-I为“中兴I号”凡纳滨对虾，JK为从夏威夷海洋研究所进口的凡纳滨对虾，Market为市场购买的凡纳滨对虾。
图2为“中兴I号”凡纳滨对虾、进口凡纳滨对虾、市场凡纳滨对虾3个群体内90个个体的遗传距离UPGMA聚类结果，其中广30为“中兴I号”凡纳滨对虾群体，31飞0为市场凡纳滨对虾群体，6广90为进口凡纳滨对虾群体。
具体实施方式
实施例I :微卫星位点的筛选及其多态性标记的确定
实验中所用的凡纳滨对虾来自随机在市场上购买的凡纳滨对虾、于湛江863基地选育的抗WSSV凡纳滨对虾“中兴I号”家系，夏威夷海洋研究所进口的凡纳滨对虾。
I、微卫星位点的来源及微卫星序列的筛选
从NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库收集并下载(以 FASTA 格式)已有的凡纳滨对奸(Litopenaeus vannamei )EST序列,利用批量序列拼接工具CAP3软件对FASTA格式的ESTs序列进行拼接和聚类，然后利用微卫星位点查找软件SSRhunter对其进行微卫星序列的搜索，对于2飞个碱基重复单元数大于5的微卫星片段进行筛选分离，得到原始 EST 序列 LV_GL_RA09G18f，LV_HC_RA071F01f，LV_HC_RA074D14f，LV_ES_RA17P12f，LV_ES_RAllM06f。
2、微卫星引物标记的引物设计
在微卫星重复序列的两端侧翼序列利用Primer Primer 5. 0设计引物；引物设计要求
(I)引物所处位置不应有未确定的序列；
(2)引物既不能离核心序列太近又不能太远，大约1(T60 bp;
(3)引物序列由18 27个核苷酸组成，多为23 bp左右，产物应在8(T500 bp之间；
(4)引物序列应富含G/C，G/C含量一般为4(T60%，G/C规则分布，上下游引物的
G/C含量不能相差太大；G/C含量大于40% ；
(5)弓I物最好在5 ’和3 ’端含有一个G/C，要注意避免连续A/T超过5个核苷酸；
(6)引物的Tm值应控制在57 68°C之间，如果不行可以考虑控制在45 65°C，两条引物的长度和Tm值不应该差别太大，并且引物之间尽量避免二聚体或发夹结构；
(7)引物之间应该是低互补性或无互补性的，3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
采用引物设计软件Primer Primer 5. 0对上述EST序列进行引物设计,分别得到LV_GL_RA09G18f 微卫星引物 Cz20, LV_HC_RA071F01f 微卫星引物 Czll7，LV_HC_RA074D14f微卫星引物Fxl51，LV_ES_RA17P12f微卫星引物Fxl97，LV_ES_RAllM06f微卫星引物Fx4。
表I凡纳滨对虾微卫星弓I物序列及特征
权利要求
1.一种凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物，其特征在于特异引物共5对，分别命名为 Cz20、Czll7、Fxl51、Fxl97、Fx4，其中
Cz20 F SEQ ID NO: I, R SEQ ID NO:2 ；
Czll7 F SEQ ID N0:3, R SEQ ID NO:4 ；
Fxl51 F SEQ ID N0:5, R SEQ ID NO:6 ；
Fxl97 F SEQ ID NO:7，R SEQ ID NO:8 ；
Fx4 F SEQ ID N0:9, R SEQ ID NO: 10。
2.根据权利要求
I所述凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物，其特征在于引物设计的参数为(I)引物所处位置的序列确定；(2)弓丨物离核心序列1(T60 bp ;(3)引物序列由18 27个核苷酸组成，产物在80 500 bp之间；(4)引物序列G/C含量为40 60% ； (5)连续A/T不超过5个核苷酸；(6)弓丨物的Tm值在45飞8°C之间；(7)引物之间为低互补性或无互补性，引物3’端的连续碱基不超过3个。
3.权利要求
I所述凡纳滨对虾EST微卫星标记特异引物的应用，其特征在于所述应用为筛选凡纳滨对虾EST微卫星标记、凡纳滨对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱构建、重要经济性状定位、功能基因研究、辅助凡纳滨对奸分子遗传育种或养殖。
4.根据权利要求
3所述凡纳滨对虾EST微卫星标记特异引物的应用，其特征在于当应用在筛选凡纳滨对虾EST微卫星标记时，包括以下步骤利用数据库中凡纳滨对虾EST序列进行拼接和聚类，然后进行微卫星位点的查找；对于2飞个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的EST序列；利用凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物进行扩增，对同一模板进行3次重复扩增后，用PIC_6. 0软件评估多态性，选择PIO0. 25的EST序列为微卫星标记。
5.根据权利要求
4所述凡纳滨对虾EST微卫星标记特异引物的应用，其特征在于所述扩增的反应体系为正反向引物各为0. 2 u mol/L, 0.2 mmol/L dNTP, IXPCR Buffer,2.0 mmol/L Mg2+, 0. 6 U Taq 酶,50 ng DNA 模板,用双蒸水补足至 20 u L0
6.根据权利要求
5所述凡纳滨对虾EST微卫星标记特异引物的应用，其特征在于扩增反应时，各对引物退火温度条件分别为SEQ ID NO: I 2为55°C，SEQ ID N0:3 4为48°C，SEQ ID NO: 5 6 为 55°C，SEQ ID NO: 7 8 为 51°C，SEQ ID NO: 9 10 为 50°C。
7.利用权利要求
I所述凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物检测微卫星多态性的方法，其特征是将来源不同的凡纳滨对虾基因组模板进行PCR扩增，其产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker作为分子量标准，检测微卫星的多态性。
专利摘要
本发明公开了一种凡纳滨对虾EST微卫星标记的特异引物，其特异引物共5对，核苷酸序列如SEQIDNO1~10所示。本发明还公开了特异引物在筛选凡纳滨对虾EST微卫星标记、凡纳滨对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱的构建、重要经济性状的定位、功能基因的研究、辅助凡纳滨对虾分子遗传育种或养殖中的应用。与现有技术相比，本发明公开的微卫星标记的特异引物具有高效、简便、快速筛选所需微卫星标记的特点。
文档编号C12N15/11GKCN101942437 B发布类型授权 专利申请号CN 201010259991
公开日2012年9月5日 申请日期2010年8月23日
发明者何建国, 吕玲, 张付霞, 李朝政, 翁少萍 申请人:中山大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),