一种能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修复菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术，特别是一种能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修 复菌剂。
【背景技术】
[0002] 饲料的霉菌污染是直接影响养殖业产品质量重要因素。据联合国粮农组织（FAO) 估算，目前世界上至少有25%的谷物被霉菌和霉菌毒素污染，每年所造成的经济损失高达 数亿美元。我国霉菌和霉菌毒素污染状况更不容乐观，仅北京地区，谷物霉菌毒素污染率竟 达90%，其中严重污染而应当禁用的达15-25%。在气候温暖的南方地区霉菌污染情况更为 严重。霉菌一般都会产生霉菌毒素，如常见的黄曲霉会产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素是毒性 最强、危害最大的。黄曲霉毒素能引起肝坏死、降低生产效率，导致先天性缺陷、促进肿瘤产 生以及抑制免疫系统等。危害较大的霉菌毒素还有：玉米赤霉烯酮（F2毒素)、呕吐毒素和 单端孢霉烯酮（T2毒素)，这些毒素均由镰刀菌产生，也都具有强烈的毒性，对动物、植物和 人体危害极大。导致人参种植重茬病产生的主要原因是人参土壤内受到镰刀菌【霉菌的一 种，能产生玉米赤霉烯酮（F2毒素)、呕吐毒素和单端孢霉烯酮（T2毒素）等】及其所产毒素 的污染。
[0003] 谷物饲料的防霉，除严格控制水分，尽量缩短储藏等措施外，添加防霉剂，防止谷 物饲料霉菌污染是更重要的措施。传统的物理和化学方法去除霉菌毒素存在效果不稳定、 营养成分损失大、饲料适口性差，难以规模化生产等缺点，较难广泛用于生产实践。微生物 及生物酶解毒因具有效率高、特异性强、对饲料和环境无污染等特点和优势，备受研究者的 关注。霉菌毒素生物降解指微生物、植物及其代谢产生的酶与毒素作用，使其分子结构中毒 性基团被破坏而生成无毒降解产物的过程.目前，市场上存在的防霉剂主要有丙酸盐类、 苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐等。这些防霉剂，具有较广的抗菌谱，对霉菌和其它真菌、酵母 菌等都有一定的抑制作用。但是，这些防霉剂仅能抑制霉菌，并不能分解或促进霉菌毒素分 解。土壤消毒剂也仅是杀灭一些霉菌，也不能降解霉菌所产的毒素。因此，筛选多种有效菌， 不仅抑制霉菌并且能够降解霉菌所产毒素，是势在必行，是更科学、更有意义的技术方法。 制成微生物饲料添加剂（吸附于灭菌麦麸)，用于修复动物肠道生态系统。若制成土壤生态 修复剂(吸附于秸杆生物炭)，可以修复因霉菌和霉菌毒素污染造成的重茬病生态系统。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于针对上述存在问题，提供一种高密度、高活性的能抑制霉菌并降 解霉菌毒素的生态修复菌剂。
[0005] 本发明的技术方案： 一种能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修复菌剂，由枯草芽孢杆菌（ 5?办ii/is ACCC10619)、沼泽红假单胞菌（押/狀iris ACCC10649 )、 奠肠球菌/aeca/is ACCC10180)、黄杆菌（新分 离，ACCC19729)和产朊假丝酵母WiB1S ACCC20060)混合组成，其中枯草芽孢 杆菌、沼泽红假单胞菌、粪肠球菌和产朊假丝酵母购于中国农业微生物菌种保藏管理中心 (ACCC)，也是农业部允许在微生物饲料添加剂中使用的菌种，黄杆菌是从吉林省通化市人 参种植土中新分离的菌种，经ACCC基因鉴定为黄杆菌（FawiersieB/a/seflii)，已经送中 国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC)保藏。
[0006] -种所述能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修复菌剂的制备方法，将菌种分别接 种于相应的无菌培养基中进行发酵，经过三级扩大培养，最后吸附、固化于秸杆生物炭上制 得固体菌剂，具体步骤如下： 1) 将冰箱冷藏保存的各斜面菌种活化后，分别经摇瓶扩大培养制成一级种子液； 2) 将上述各菌种一级种子液分别在灭菌培养基内进行二级扩大培养制成二级扩大培 养液，枯草芽胞杆菌、沼泽红假单胞菌、粪肠球菌和黄杆菌培养条件是：接种量为5-lOwt%、 温度37土 1°C、pH值L 0±(λ 2、搅拌速度100-150r/min、压力(λ 05MPa，产朊假丝酵母的培 养条件是：温度30 ± I °C，其它培养条件与上述四个种菌种相同。
[0007] 3)将上述各菌种二级培养液分别在灭菌培养基内进行三级扩大培养制成三 级扩大培养液，枯草芽胞杆菌、沼泽红假单胞菌、粪肠球菌和黄杆菌培养条件是：接种量 5-10￥七％、温度37±11：、口!1值7.0±0.2、搅拌速度 200-25017^11、压力0.05 1〇^;产朊假丝 酵母扩大培养条件是：温度30±1°C .其它培养条件与上述四种细菌相同。
[0008] 4)将上述五个菌种的三级扩大培养液，按质量比1: 1: 1: 1:1的比例混合均匀，得 到菌剂混合液； 5) 将上述菌剂混合液喷洒于秸杆生物炭上，边喷洒边搅拌，使菌液均匀地吸附、固化于 秸杆生物炭上制得固体菌剂； 6) 将制成的固体菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内，室温保存，防潮、防暴晒。
[0009] 所述菌种活化方法是：把琼脂斜面保存的各菌菌种从冰箱冷藏室取出，放于超净 工作台内，在酒精灯火焰旁，分别转接于琼脂平板培养基上，在30-37°C下培养20-30h后， 平板上生长出大大小小的菌落，再从平板上菌落中挑取单菌落转接于灭菌试管中的培养液 中。
[0010] 所述活化后的每个菌种扩大培养的培养基分别是：枯草芽胞杆菌的培养基为牛肉 膏蛋白胨培养基（NA)，再添加质量分数为0. 5%的蔗糖，pH值7. 0±0. 2 ;沼泽红假单胞菌 的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（NA)，再添加质量分数为0. 1%的乙酸钠，pH值7. 0±0. 2 ; 粪肠球菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（NA)，再添加质量分数为0.2%酵母膏，pH值 7. 0±0. 2 ;黄杆菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（NA)，pH值7. 0±0. 2 ;产朊假丝酵母的 培养基为PDA培养基，自然pH值；各菌培养基的灭菌条件：压力为0. IMPa、温度为121°C、时 间 30min。
[0011] 所述秸杆生物炭是将玉米秸杆粉粹后，在厌氧或少氧条件下，400-45(TC加热 12-14h制备成的无菌炭化物，菌种混合液与秸杆生物炭的质量比为1:4-5。
[0012] 本发明的优点是：该生态修复菌剂具有高密度、高活性的优良特性。其中枯草芽孢 杆菌、沼泽红假单胞菌、粪肠球菌以及新分离出的黄杆菌均有抑制霉菌并能降解霉菌毒素 的作用，尤其是与产阮假丝酵母配合，其降解霉菌毒素的作用明显增加；该生态修复菌剂可 以作为饲料添加剂解决饲料行业霉菌及霉菌毒素污染问题，也可以作为土壤生态修复剂解 决人参、三七种植中重茬病漫延的问题。
【具体实施方式】
[0013] 实施例： 一种能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修复菌剂，由枯草芽孢杆菌（ 5?办ii/is ACCC10619)、沼泽红假单胞菌pa/iAstris ACCC10649 )、奠 肠球菌（ihierococcWs /aeca/is ACCC10180)、黄杆菌（ACCC19729」 和产朊假丝酵母WiB1S ACCC20060)混合组成，其中枯草芽孢杆菌、沼泽红假单 胞菌、粪肠球菌和产朊假丝酵母购于中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC)，也是农业 部允许在微生物饲料添加剂中使用的菌种，黄杆菌是从吉林省通化市人参种植土中新分离 的菌种，经ACCC基因鉴定为黄杆菌（r故ztersieB/a/smii)，已经送中国农业微生物菌种 保藏管理中心（ACCC)保藏。
[0014] 所述能抑制霉菌并降解霉菌毒素的生态修复菌剂的制备方法，将菌种分别接种于 相应的灭菌培养基中进行发酵，经过三级扩大培养，最后吸附、固化于秸杆生物炭上制得固 体菌剂，具体步骤如下： 1) 将冰箱冷藏保存的各斜面菌种活化后，分别经摇瓶扩大培养制成一级种子液； 2) 将上述各菌种一级种子液分别在无菌培养基内进行二级扩大培养制成二级扩大培 养液，枯草芽胞杆菌、沼泽红假单胞菌、粪肠球菌和黄杆菌培养条件是：接种量为l〇w%、温 度37土 1°C、pH值7.0±0.2、搅拌速度100-150r/min、压力0.05MPa，产朊假丝酵母的培养 条件是：温度30 ± I °C，其它培养条件与上述四个种