培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养2?8h，以获得二级种子培养液；
[0045] (3)发酵罐培养：在 33 ?39°C、100 ?250rpm(优选 150-250rpm)、氮气 0· 5 ? IOvvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10?100的体积比进行发 酵罐培养，并使发酵液的PH保持为6. 5?7. 5 (优选向所述发酵液中流加浓度为1?15mol/ L的NaOH)，以生产所述1，3-丙二醇（可用高效液相色谱对所生产的1，3-丙二醇进行定性 和定量分析）。
[0046]所述种子培养基为：甘油，10 ?40g/L ;K2HP04 · 3H20, 2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2S04,2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20,2 ?5g/L ;CaCl2 · 2H20,2 ?5g/L ;酵母粉，I ?lOg/L ; 微量元素溶液，I?lOmL/L ;Fe溶液，I?lOmL/L ;自然pH。所述发酵培养基为：甘油30? 500g/L ;K2HP04 ·3Η20,0· 1 ?2. Og ;ΚΗ2Ρ04,0· 1 ?2. Og ; (NH4)2S04,0. 5 ?5. Og ;MgS04 ·7Η20， 0· 1 ?I. Og ;CaCl2 · 2Η20,0· 01 ?0· 2g ;酵母粉，0· 5 ?5· Og ;微量元素溶液，1 ?10mL/L ; Fe溶液1?10mL/L。每升所述Fe溶液中含有FeSO4 ·7Η201?IOg ;37% HCll?40mL。每 升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2,0. 01 ?0· 2g ;MnCl2 ·4Η20，(λ 01 ?0· 2g ;Η3Β03，(λ 01 ? 0· Ig ;CoCl2 · 6Η20,0· 1 ?0· 5g ;CuCl2 · 2Η20,0· 01 ?0· 05g ;NiCl2 · 6Η20,0· 02 ?0· 05g ; Na2MoO4 · 2H20,0. 01 ?0. 06g ;37% HC1，1 ?9mL。
[0047] 实施例3
[0048] 利用实施例I获得的丁酸梭菌MOl在5L发酵罐中生产1，3-丙二醇，包括如下步 骤：
[0049] (1)种子培养：用无菌注射器取1?IOmL 丁酸梭菌MOl菌液接种于装有50? IOOmL种子培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养8?16h，以获得一级种 子培养液；
[0050] ⑵种子扩大培养：用无菌注射器取1?IOmL种子液接种于装有50?IOOmL种子 培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养2?8h，以获得二级种子培养液；
[0051] (3)发酵罐培养：在37°C、150rpm、氮气0. 5vvm条件下，将所述一级或二级种子培 养液与发酵培养基以1:10的体积比进行发酵罐培养，发酵培养基用量为2L，并向所述发酵 液中流加浓度为4mol/L的NaOH使发酵液的pH保持为7. 0,以生产所述1，3-丙二醇（可用 高效液相色谱对所生产的1，3-丙二醇进行定性和定量分析），该步骤的发酵曲线如图1所 不O
[0052] 所述种子培养基为：甘油，20g/L ;K2HP04 · 3Η20,4· 45g/L ;KH2P04,1. 3g/L ; (NH4)2SO4, 2g/L ;MgS04 · 7H20, 2g/L ;CaCl2 · 2H20, 2g/L ;酵母粉，lg/L ;微量元素溶液，lmL/L ; Fe 溶液，lmL/L ;自然 pH。所述发酵培养基为：甘油 50g/L ;K2HP04 · 3H20, Ig ;ΚΗ2Ρ04,0· 5g ; (NH4)2S04,2g ;MgS04 · 7Η20,0· 2g ;CaCl2 · 2Η20,0· 02g ;酵母粉，Ig ;微量元素溶液，lmL/L ;Fe 溶液lmL/L。每升所述Fe溶液中含有FeSO4 · 7H20 5g ;37% HCl 4mL。每升所述微量元素 溶液中包括：ZnCl2,0· 07g ;MnCl2 · 4H20,0· Ig ;H3B03, 0· 06g ;CoCl2 · 6H20,0· 2g ;CuCl2 · 2H20， 0· 02g ;NiCl2 · 6H20,0. 025g ;Na2Mo04 · 2H20,0. 035g ;37% HCl，9mL。
[0053] 实施例4
[0054] 利用实施例I获得的丁酸梭菌MOl在IOOL发酵罐中生产1，3-丙二醇，包括如下 步骤：
[0055] (1)种子培养：用无菌注射器取1?IOmL 丁酸梭菌MOl菌液接种于装有50? IOOmL种子培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养8?16h，以获得一级种 子培养液；
[0056] (2)种子扩大培养：用无菌注射器取1?IOmL种子液接种于装有50?IOOmL种子 培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养2?8h，以获得二级种子培养液；
[0057] (3)发酵罐培养：在37°C、250rpm、氮气2. 5vvm条件下，将所述一级或二级种子 培养液与发酵培养基以1:20的体积比进行发酵罐培养，发酵培养基用量为60L，并向所述 发酵液中流加浓度为4mol/L的NaOH使发酵液的pH保持为7. 0,以生产所述1，3-丙二醇 (可用高效液相色谱对所生产的1，3-丙二醇进行定性和定量分析，结果如图3所示，其中 1，3-丙二醇出峰时间为20. 228min)，该步骤的发酵曲线如图2所示。
[0058] 各培养基同实施例1。
[0059] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种丁酸梭菌M01，其特征在于：于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0. 9626。
2. -种权利要求1所述的丁酸梭菌MOl的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤： 取采集样品lg，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37°C密封富集培养24h后转入种 子培养基，37°C厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能够生 产1，3-丙二醇的阳性菌；于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产1，3-丙 二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析鉴定； 上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，l〇g/L ;牛肉膏，10g/L ;酵母粉，3g/L ;葡萄糖， 5g/L ;NaCl，3g/L ;NaAc，3g/L ;可溶性淀粉，lg/L ;半胱氨酸盐酸盐，0· 5g/L ;pH 7. 5。
3. 如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述种子培养基为：甘油，10?40g/ L ;K2HP04 · 3H20, 2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2SO4, 2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20, 2 ?5g/L ; CaCl2 ·2Η20, 2?5g/L ;酵母粉，I?lOg/L ;微量元素溶液，I?lOmL/L ;Fe溶液，I?IOmL/ L ;自然pH。
4. 如权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于：每升所述Fe溶液中含有 FeSO4 · 7H201 ?IOg ;37% HCll ?40mL。
5. 如权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于：每升所述微量元素溶液中包括： ZnCl2,0. 01 ?0· 2g ;MnCl2 · 4Η20,0· 01 ?0· 2g ;Η3Β03,0· 01 ?0· Ig ;CoCl2 · 6Η20,0· 1 ? 0. 5g ;CuCl2 ·2Η20,0. 01 ?0. 05g ;NiCl2 ·6Η20,0. 02 ?0. 05g ;Na2Mo04 ·2Η20,0. 01 ?0. 06g ; 37% HC1，1 ?9mL〇
6. -种应用权利要求I所述的丁酸梭菌MOl生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：包 括如下步骤： (1) 种子培养：用无菌注射器取1?IOmL 丁酸梭菌MOl菌液接种于装有50?IOOmL 种子培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养8?16h，以获得一级种子培养 液； (2) 种子扩大培养：用无菌注射器取1?IOmL种子液接种于装有50?IOOmL种子培 养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养2?8h，以获得二级种子培养液； (3) 发酵罐培养：在33?39°C、100?250rpm、氮气0· 5?IOvvm条件下，将所述一级 或二级种子培养液与发酵培养基以1:10?100的体积比进行发酵罐培养，并使发酵液的PH 保持为6. 5?7. 5,以生产所述1，3-丙二醇。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子培养基为：甘油，10?40g/L ; K2HPO4 · 3H20,2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2S04,2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20,2 ?5g/L ; CaCl2 ·2Η20, 2?5g/L ;酵母粉，I?lOg/L ;微量元素溶液，I?lOmL/L ;Fe溶液，I?IOmL/ L ;自然pH。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为：甘油30?500g/L ; K2HPO4 · 3Η20,0· 1 ?2. Og ;ΚΗ2Ρ04,0· 1 ?2. Og ; (NH4)2S04,0. 5 ?5. Og ;MgS04 · 7Η20,0· 1 ? 1. Og ;CaCl2 · 2Η20,0· 01 ?0· 2g ;酵母粉，0· 5 ?5. Og ;微量元素溶液，1 ?10mL/L ;Fe 溶液 1 ?10mL/L〇
9. 如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：每升所述Fe溶液中含有FeSO4 ·7Η201? IOg ;37% HCll ?40mL。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2, 0· 01 ?0· 2g ;MnCl2 · 4Η20,0· 01 ?0· 2g ;Η3Β〇3,0· 01 ?0· Ig ;CoCl2 · 6Η20,0· 1 ?0· 5g ; CuCl2 ·2Η20,0. 01 ?0. 05g ;NiCl2 ·6Η20,0. 02 ?0. 05g ;Na2Mo04 ·2Η20,0. 01 ?0. 06g ;37% HC1，I ?9mL〇
【专利摘要】本发明公开了一种丁酸梭菌及其应用，该丁酸梭菌于2014年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9626。本发明的丁酸梭菌易于培养，具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性。CGMCC NO.962620140901
【IPC分类】C12R1-145, C12P7-18, C12N1-20
【公开号】CN104560779
【申请号】CN201410696268
【发明人】方柏山, 邱隆辉, 王世珍
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月26日