yg线性化质粒混合后转 移至冰预冷的2mm电转杯中，于冰上放置5分钟，使用Gene Pulser Xcell电转仪电转化 DNA，电转条件为：1500V，25yV，200Q。电转后迅速加入lml冰预冷的酵母浸出粉胨葡萄糖 山梨醇缓冲液轻轻混匀后于24?30°C静置至少2小时，取100?300y1涂布于毕赤酵母 腺嗓呤缺陷筛选平板，于30°C培养5?6天。
[0034] 培养基 含0. lmg/mL氨苄西林霉素的LB平板：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克和琼脂粉15克；终浓度为0. lmg/mL的氨苄西林霉素，加双蒸水定容至1升。
[0035] 毕赤酵母腺嘌呤缺陷筛选平板：每升含有含有硫酸铵而不含氨基酸的酵母氮碱基 13. 4g，腺嘌呤氨基酸混合物1.25g，琼脂粉20克，生物素5毫克，10 X葡萄糖100毫升，加 双蒸水定容至1升。
[0036] 酵母浸出粉胨葡萄糖复合培养基琼脂平板：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20 克，葡萄糖20克，琼脂粉20克，加双蒸水定容至1升。
[0037] 甘油复合物缓冲液培养基和甲醇复合物缓冲液培养基：每升包含酵母提取物10 克，蛋白胨20克，100毫摩尔pH6. 0磷酸钾缓冲液，含有硫酸铵而不含氨基酸的酵母氮碱基 13. 4g，生物素0.004克，其中甘油复合物缓冲液中加入10 X甘油100毫升，而甲醇复合物 缓冲液中加入10X甲醇100毫升，加双蒸水定容至1升。
[0038] 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，葡萄糖20 克，加双蒸水定容至1升。
[0039] 酵母浸出粉胨葡萄糖山梨醇缓冲液：每升包含酵母提取物10克，蛋白胨20克，葡 萄糖20克，山梨醇182. 2克，加双蒸水定容至1升。
[0040] Tris盐-吐温20缓冲液：每升含有25毫摩尔Tris碱3克，150毫摩尔甘氨酸11. 3 克，20%的甲醇200毫升，加双蒸水定容至1升。
[0041] 测定法 生长曲线测定 将不同取样点的酵母培养物，稀释适当倍数后(约10?100倍，在稀释倍数与600纳米 波长处吸光值具有线性相关性的区间)，取等体积的酵母培养物，用双蒸水洗两次后，取1毫 升处理后的酵母培养物，使用Eppendorf分光光度计测量600纳米波长处吸光值，乘上稀释 倍数获得实际600纳米波长处吸光值。之后以600纳米波长处吸光值为纵坐标，以培养时 间为横坐标，使用GraphPad Prism软件作图分析。
[0042] 蛋白免疫印迹检测 不同取样点的酵母培养物样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶（分离胶质量浓度为12%)电泳 分离后使用Bio-Rad半干转膜仪300毫安恒流条件下转聚偏二氟乙烯膜1小时。封闭液(每 升含脱脂奶粉50克）封闭1小时，鼠抗人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白LI IgG2a单克隆 抗体一抗孵育1. 5小时，用Tris盐-吐温20缓冲液洗膜三次，每次5分钟；之后用辣根过 氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗孵育1小时，Tris盐-吐温20缓冲液洗膜三次，Tris盐 缓冲液洗膜两次，每次5分钟，加入Pierce?ECL显色底物孵育1~2分钟后，用X光片曝光显 色。
[0043] 实施例:在甲醛脱氢酶启动子控制下诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白 L1 甲醛脱氢酶启动子的克隆与构建通过下述步骤完成。从Genebank数据库中搜索获得 甲醛脱氢酶启动子基因序列（Genebank序列号：AF066054)，根据基因序列设计启动子核苷 酸片段扩增引物。
[0044] 使用20微升反应液进行甲醛脱氢酶启动子核苷酸片段扩增，所述反应液包括2微 升10 XExtaq酶缓冲液，1. 6微升dNTP混合物，50微摩尔浓度的上、下游引物各0. 25微升，0. 5微升Extaq酶，2微升毕赤酵母细胞系GS115菌液，双蒸水13. 4微升。PCR扩增反应条 件为95°C，预变性3分钟；72°C，热启动2分钟，同时向反应体系中加入高保真taq酶；之后 95°C，变性30秒；52°C，退火40秒；72°C，延伸1分钟；最后72°C，再延伸10分钟，共34 个循环。
[0045] 将扩增的0.59k个碱基对的核苷酸片段使用UniversalDNA纯化回收试剂盒(天 根生化科技(北京）有限公司）纯化后亚克隆进TA克隆载体pMD?18-T(连接反应体系为：甲 醛脱氢酶启动子基因1微升，TA克隆载体pMD?18-T1微升，双蒸水3微升，溶液I5微升 (溶液I是TA克隆载体试剂盒里自带的缓冲液指什么）），得到的质粒经序列测定（上海生 工生物工程有限公司）正确后用于下一步重组质粒克隆。
[0046] 用限制性内切酶你/II和fcal(+feoRI)双酶切/^-pMD?18-T载体后所得甲 醛脱氢酶启动子片段PFU)，与限制性内切酶你711和feoRI双酶切质粒pPink-HC所得载体 以T4连接酶16°C连接过夜，转化、涂板，提取质粒酶切鉴定的阳性克隆质粒pPinkFLD-HC。
[0047] 质粒pPinkFLD-HC用限制性内切酶和fcal(+feoRI)双酶切消化后所 得核苷酸片段（核苷酸片段长约〇. 7k个碱基对）与用限制性内切酶他rl和I双酶 切的质粒pPinkA0Xl-HPV16Ll所得载体，以T4连接酶16°C连接过夜，转化、涂板，提取质粒 酶切鉴定，鉴定正确的质粒即为表达质粒pPinkFLD-HPV16Ll。
[0048] 酶切质粒/^ipMDTMlS-T反应体系为：质粒Z^m-pMDTmiS-TO. 56yg/y1 10 微升， 你/IIl微升，feaI(+^boRI)l微升，10XTbuffer3微升，0?l%BSA0?3微升，双蒸水 14. 7微升。
[0049] 酶切质粒pPink-HC反应体系为：质粒pPink-HC0? 73yg/y1 10微升，你711 1. 5 微升，feoRI1.5微升，10XHbuffer3微升，双蒸水14微升。
[0050] 质粒pPinkFLD-HC连接反应体系为：连接反应体系为：片段PFU)1微升，载体1微 升，10XT4buffer1微升，T4连接酶1微升，双蒸水6微升；其中，PFU)基因和载体的连接 摩尔浓度比为1:3。
[0051] 酶切质粒pPinkFLD-HC:质粒pPinkFLD-HC0? 65yg/y1 10 微升，I1 微升， 也31(+及^1)1微升，10\册8131^€6143微升，100\85六0.3微升，双蒸水14.7微升。
[0052] 酶切质粒pPinkA0Xl-HPV16Ll:质粒pPinkA0Xl-HPV16Ll0.65yg/y1 15 微升， M^rIl微升，^boRIl微升，10XTbuffer3微升，0?l%BSA0?3微升，双蒸水9?7微升。
[0053] 质粒pPinkFLD-HPV16Ll连接反应体系为：核苷酸片段1微升，载体2微升，10XT4 buffer1微升，T4连接酶1微升，双蒸水5微升；其中，核苷酸片段和载体的连接摩尔浓度 比为1:3。
[0054] 质粒pPinkFLD-HPV16Ll酶切鉴定反应体系为：质粒pPinkFLD-HPV16Ll1微升， I0? 2 微升，命/?I0? 2 微升，10XTbuffer1 微升，0? 1%BSA0? 1 微升，双蒸水 7. 5 微 升。
[0055] 该质粒pPinkFLD-HPV16Ll转化大肠杆菌DH5a后，使用质粒小提试剂盒(天根生 化科技(北京)有限公司）提取质粒，用限制性内切酶5^1于37°C单酶切消化3小时后，酶 切产物使用UniversalDNA纯化回收试剂盒(天根生化科技(北京）有限公司）纯化回收酶 切线性化质粒，测定质粒DNA浓度。
[0056] 其中质粒pPinkFLD-HPV16Ll酶切反应体系为：质粒pPinkFLD-HPV16Ll 0?373yg/yll5微升，5^Il?2微升，10XMbuffer3微升，双蒸水10?8微升。
[0057] 取纯化回收的酶切线性化质粒质粒（约5yg以上）电转化毕赤酵母 PichiaPink^^trai/? /感受态细胞，转化后取200y1该转化菌液涂布于毕赤酵母腺嘌呤缺 陷筛选平板，于30°C倒置培养4~5天，可见菌落，得到质粒pPinkFLD-HPV16Ll表达克隆子。 随机挑取多个白色单菌落分别接种于装有5ml甘油复合物缓冲液培养基的试管中30°C、 280rpm培养24小时后，菌液离心后，弃去上清，向试管中加入5ml甲醇复合物缓冲液培养基 诱导表达，24小时后取样检测人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达情况，将有表达的 菌落保存作为种子甘油菌。
[0058] 取上述保存的种子甘油菌划酵母浸出粉胨葡萄糖培养基琼脂平板，待菌落形成 后，挑取一个单克隆接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，30°C、280rpm培养过夜24小时， 得到一级种子液。之后将5ml-级种子液接种至甘油复合物缓冲液培养基中，30°C、280rpm 培养过夜获得二级种子液。24小时后分别取获得的二级种子液等量8份，分别经1500g、离 心5分钟后，弃上清液，分别将8份沉淀使用上述8种相应的诱导培养基重悬回三角瓶中进 行HPV16L1蛋白诱导表达。8种诱导培养基分别为葡萄糖-硫酸铵混合培养基、葡萄糖-甲 胺混合培养基、甘油-硫酸铵混合培养基、甘油-甲胺混合培养基、山梨醇-硫酸铵混合培 养基、山梨醇-甲胺混合