一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用

一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一种具有产电能力和能将巴卡亭III转化生成 10-DAB的新菌株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 1.产电微生物
[0003] 微生物燃料电池 （Microbial Fuel Cells, MFCs)是一种利用微生物做催化剂氧化 有机物并直接将化学能转化成电能的新型装置，它结合燃料电池与生物学技术手段，实现 了生物化学能与电能的直接转化，是一种清洁的可持续能源，已逐渐成为新能源开发的焦 点。
[0004] 产电微生物（Electricigens)是指那些能够在厌氧条件下完全氧化有机物，把氧 化有机物获得的电子通过电子传递链传递到细胞外，直接或间接地通过介质（Mediator) 将电子传递到电极上产生电流的微生物，同时微生物在电子传递过程中获得能量支持生 长。产电微生物作为微生物燃料电池中重要的生物催化剂，直接影响产电效率。因此挖掘 更多具有这种功能的微生物对于丰富产电微生物的多样性，提高产电效率具有重要意义。
[0005] 目前已报道的能在无介体条件下运行MFCs产电的微生物包括细菌类和真菌 类。其中，细菌类产电微生物主要包括希瓦氏菌属（Shewanella)、地杆菌属（Geobacter)、 假单胞菌菌属（Pseudomonas)、弓形菌属（Arcobacter)、产氢细菌家族的产电菌（如丁 酸梭菌（Clostridium butyricum)、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)、铁还原红 螺菌（Rhodoferax ferrireducens)、人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi)、耐寒细菌 (Geopsychrobacter electrodiphilus)、克雷伯氏月市炎菌（Klebsiella pneumoniae L17) 等。真菌类的产电微生物主要包括异常汉逊酵母（Hansenula anomala)、沼泽红假单孢菌 (Rhodopseudomonas palustris)、小球藻（Chlorellavulgaris)等。但至今尚未发现拉乌 尔菌属的菌株具有产电性能。
[0006] 2. IO-DAB 的制备
[0007]多烯紫杉醇是经结构修饰的紫杉烷类抗肿瘤药物的典型代表，具有高效广谱的抗 肿瘤活性，目前己经成为卵巢癌、乳腺癌等肿瘤治疗的一线药物。而IO-DAB是合成抗癌药 物多烯紫杉醇的重要前体物质。
[0008] IO-DAB广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中。传统的提取方法需要多次 层析、梯度洗脱、多次重结晶后才能获得精制品。这不仅造成IO-DAB的大量损失，降低了收 率，而且过程中还使用了大量易燃的石油醚和有毒性的乙腈，对环境造成不良影响。而利用 微生物转化技术能将巴卡亭III转化生成10-DAB，该过程具有专一性高，副产物生成少，反 应条件温和、环境友好等优点。
[0009] 目前已报道的能以巴卡亭III为底物，转化生成IO-DAB的微生物主要有：白色类 诺卡氏菌（Nocardioides albus)、黄色类诺卡氏菌（Nocardioides Iuteus)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、稻草假单胞菌（Pseudomonas straminea)、成团泛菌（Pantoea agglomerans)、红球菌（Rhodococcus sp·)、莫拉氏菌（Moraxella sp.)等。至今尚未发现 拉乌尔菌属的菌株具备将巴卡亭III转化生成IO-DAB的能力。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的在于提供一株具有产电能力且能将巴卡亭III转化生成10-DAB的 新菌株及研宄其在微生物燃料电池和制备10-DAB方面的应用。
[0011] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0012] -株解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19,菌株保藏编号： CGMCC No. 10267,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址： 中国北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期：2014年12月30日。
[0013] 而且，所述菌株具有产电能力和将巴卡亭III转化生成10-DAB的能力，
[0014] 而且，所述菌株应用于微生物燃料电池中表现出产电能力。
[0015] 而且，所述菌株含有或表达C-10脱乙酰基酶。
[0016] 一种具有产电能力和将巴卡亭III转化生成10-DAB的菌株的筛选方法，步骤如 下：
[0017] ⑴富集
[0018] 待筛选污泥浓缩间的污泥经过简单的淘洗和沉淀处理后，去掉底层无机化的沉淀 物和表层的清水，取中间含水率在95%左右的污泥作为接种物，和污泥营养液一起加入微 生物燃料电池的反应器中，连续运行10-20d，负载电阻两端的电压逐渐稳定，此时，阳极上 形成肉眼可见的厚的生物膜；
[0019] ⑵分离纯化
[0020] 用接种环将生物膜上的全部菌体刮下，悬浮于无菌水中制备成均匀的菌悬液，涂 布在葡萄糖作为碳源的PBBM固体培养基上，30°C厌氧培养3-5d，将长出的具有不同形态的 单菌落分别挑出，在上述相同的培养基和培养条件下进行反复的划线分离和纯化培养，最 后得到多个纯种的分离株，将其进行编号和命名；
[0021] ⑶筛选
[0022] ①将分离得到的菌株接种于阳极液I，得到的接种液注入微生物燃料电池的反应 器中，反应器与外电阻和数据采集装置连接好，室温下运行；
[0023] ②将收集得到的菌体经甲苯破碎处理后，投加底物巴卡亭III，37°C 200r/min转 化3d，通过TLC、HPLC、LC-MS对转化产物进行鉴定。
[0024] 权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19用于微生物燃料电池中进行产电的 应用。
[0025] 解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19在制作微生物燃料电 池中的应用。
[0026] 解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)P1-A-19 在制备 10-DAB 中的 应用。
[0027] 解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)P1-A-19 制备 10-DAB 的方法， 将收集得到的菌株经甲苯破碎处理后，投加底物巴卡亭m，30-40°C，180-250r/min转化 3-8d，获得 10-DAB。
[0028] 本发明的优点和积极效果如下：
[0029] 本发明以在MFCs中具有产电能力作为初步筛选条件，以转化巴卡亭III生 成10-DAB作为复筛条件，经这两个步骤的严格限制，筛选获得了一株菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19,经这两步骤条件的严格限制筛选获得具有产电性能和含C-IO 脱乙酰基酶的菌株，将菌株进行MFCs产电实验和转化巴卡亭III实验，发现菌株能产生 132mV的电压，且能将巴卡亭III转化生成IO-DAB III。
[0030] 本发明对于丰富产电微生物的多样性，挖掘更多具有高电化学活性的微生物菌种 具有重要意义；同时也进一步拓宽了用于10-DAB生物合成的微生物菌株，为开发新的紫杉 烷化合物的合成途径提供了新材料和新方法。
【附图说明】
[0031] 图 1 为本发明菌株 Raoultella ornithinolytica P1-A-19 的菌落形态图；
[0032] 图2为本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19的革兰氏染色结果；
[0033] 图3为本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19的系统发育树图；
[0034] 图 4 为本发明菌株 Raoultella ornithinolytica P1-A-19 应用于 MFCs 时的电 压-时间曲线图；
[0035] 图 5 为本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19 转化巴卡亭 III 的 TLC 结果，1 :巴卡亭III标准品（〇· 3mg/mL)，2 :10-DAB标准品（0· lmg/mL)，3 :菌体对照，4 :转化 液样品；
[0036] 图 6为本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19转化巴卡亭 III 的HPLC 结果，图6A :巴卡亭III (0· 3mg/mL)和10-DAB(0. lmg/mL)的混合标准品，图6B :转化液样 品；
[0037] 图7为本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19转化巴卡亭III的转 化产物的LC-MS图，图7A :T0F MS负离子扫描模式，图7B :T0F MS正离子扫描模式。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0039] 本发明的内容包括如下内容：
[0040] 一、通过将天津泰达污水处理厂污泥浓缩间的污泥置于单室型微生物燃料电池中 运行，以肉眼观察到的阳极上富集的生物膜为研宄对象，利用可培养的方法分离纯化得到 具有电化学活性的微生物纯种。
[0041] 二、通过运行MFCs对分离株P1-A-19的产电性能进行分析。
[0042] 三、通过TLC、HPLC、LC-MS对分离株P1-A-19转化巴卡亭III生成IO-DAB的能力 进行研宄。
[0043] 具体论述如下：
[0044] 一、菌株的分离筛选鉴定主要步骤如下：
[0045] (1)分离株的分离筛选
[0046] 待筛选污泥浓缩间的污泥经过简单的淘洗和沉淀处理后，去掉底层无机化的沉淀 物和表层的清水，取中间含水率在95%左右的污泥作为接种物，和污泥营养液一起加入微 生物燃料电池的反应器中，连续运行10-20d，负载电阻两端的电压逐渐稳定，此时，阳极上 形成肉眼可见的厚的生物膜；
[0047] 用接种环将生物膜上的微生物刮下，悬浮于无菌水中制备成均匀的菌悬液，涂布 在葡萄糖作为碳源的PBBM固体培养基上，30°C厌氧培养3d，将长出的具有不同形态的单菌 落分别挑出，在相同的培养基和培养条件下进行三区划线，30°C厌氧培养3d，经过多次分离 纯化后得到纯种的分离株，将其进行编号和命名。
[0048] (2)分离株P1-A-19的鉴定
[0049] 本发明的解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19具有如下的 形态和生理生化特性：
[0050] a.菌体的形态特征：革兰氏阴性菌，杆状；
[0051] b.菌落的形态特征：营养琼脂平板上培养24h后，菌落形态为圆形、易挑取、不透 明、表面湿润，边缘整齐的白色菌落，直径约1-1. 5mm ;
[0052] c.主要的生理生化特性引哚产生实验和尿素酶实验结果呈阳性，甲基红实验、 硫化氢实验和氧化酶实验呈阴性。
[0053] 上述结果表明，本发明的菌株P1-A-19的形态特征和生理生化特性均与文献报道 的解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica) -致。
[0054] d.本发明的解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19分子分 类地位：
[0055] 采用Easypure? Genomic DNA kit试剂盒（北京天根生物科技有限公司）提 取菌株P1-A-19总DNA并以之为模板，对16S rDNA基因序列进行PCR扩增。引物对为通 用引物27F和1492R。PCR产物直接测序，测序结果提交NCBIGenBank(National Center ofBiotechnology Information)，用BLAST进行相似性检索和同源性比较。利用MEGA5软 件，运用Neighbor-Joining法，采用Kimura2_parameter校正模型，自举1000次构建系统 发育树。
[0056] 结果显不，该菌株与 Raoultella ornithinolytica ATCC 318989 (NR 114502. 1) 的同源性最高，达到 99%，分离株 P1-A-19 与 Raoultella ornithinolytica ATCC31898 处 在系统发育树的同一分支，亲缘关系最为接近。
[0057] 综合上述结果，本发明的菌株P1-A-19鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithin