一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用_2

文档序号:8407518阅读:来源:国知局
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[0058] 二、产电性能的分析
[0059] (1)微生物燃料电池的构造和组装
[0060] 采用的是单室型MFCs反应器。它只由一个池体构成,阴极一面暴露在空气当中, 阴阳极的有效面积均为7cm 2。主体是一个长为2. 0cm,横断面直径为3. Ocm的有机玻璃柱 体,有效容积为14mL。将阳极和阴极分别置于MFCs主体的两侧,并用橡胶圈密封固定。阳 极一端用有机玻璃盖盖住,为了保证阴极和空气接触,阴极一端的盖子是开口的,且阴极碳 布载铂。阴阳电极都与钛丝连接将电子导出或导入,最后整个装置用螺丝和丝杠拧紧固定, MFCs反应器构建完成。
[0061] (2)MFCs的启动和运行
[0062] 将分离株P1-A-19接种于阳极液I,得到的接种液注入MFCs反应器中,反应器和外 电阻(没有特殊说明外电阻阻值固定在1000Ω)和数据采集装置连接好,室温下运行。 [0063] 运行过程中需要定期更换接种液(即接种了对应分离株菌体的阳极液),一般24h 更换一次,每次更换时先将MFCs内的原接种液取出,然后加入新鲜的接种液,待反应器出 现连续三个的稳定电压即可认为启动成功。启动成功后进入正式运行期,当监测的输出电 压低于50mV时,只需要更换阳极液,当输出电压再次达到最高并趋于稳定时进行极化曲线 和功率密度曲线的测定,之后停止MFCs运行。整个过程中利用PIS0-813型数据采集系 统对电压进行实时的在线数据监测和记录,分析数据时取30min内的平均值,采样精度为 0.OOlVo
[0064] (3) MFCs的电化学性能表征参数
[0065] 实验室一个小型MFCs产生的电流很小的,很难直接测量,而是通过测量外电阻上 的电压计算得出。本论文中所有MFCs产生的电压都是通过PIS0-813型数据采集系统进行 采集和记录的。MFCs产生的最高电压是开路电压,可以在外电阻无限大的情况下测得。
[0066] 按上述方法进行实验,结果表明,菌株P1-A-19应用于微生物燃料电池时表现出 电化学活性,其产生的最高电压为132mV。
[0067] 三、通过TLC、HPLC、LC-MS对分离株P1-A-19转化巴卡亭III生成10-DAB的能力 进行研宄。
[0068] ⑴将斜面上的菌体P1-A-19接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中, 30°C 200r/min培养2d。培养液离心(7000r/min,4°C,10min),倒去上清液,收集沉淀湿菌 泥,并测定菌泥质量,待用。采用甲苯处理破碎法,即每2g湿菌泥中加入0.04g NaHCO3* 8mL甲苯,37°C 200r/min摇床上振荡2. 5h,倒去甲苯,收集菌体用于转化。
[0069] ⑵收集菌体6g置于试管中,加入I. 5mg/mL的巴卡亭III甲醇溶液2mL,再补加 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)8mL,此时底物的终浓度为0. 3mg/mL。将试管置于摇床, 37°C,200r/min转化3d。实验中通过向转化体系中加入5mL氯仿用来终止反应,之后,试 管继续在37°C,200r/min条件下振荡3h以萃取转化产物,最后将氯仿有机相移至小玻璃 瓶中,置于室温下挥干溶剂。实验中,将相同菌体悬浮在IOmL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中作为空白对照。利用硅胶板对转化产物进行TLC分离,展开剂为丙酮:石油醚=2: 3(v/v),显色剂为硫酸:乙醇=I :9(v/v)。并利用HPLC、LC-MS对转化产物进行鉴定。
[0070] ⑶高效液相色谱分析(HPLC)具体方法:向样品中加入800 μ L甲醇,超声波振荡混 匀后,经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后得到供试品溶液进行HPLC分析。色谱条件:C18色谱柱 (250_X4. 6_,5 μ m);流动相:甲醇:乙腈:水(10 :33 :57,v/v/v);检测波长:227nm ;流 速:0. 8mL/min ;柱温:室温;进样量:10 yL。
[0071] ⑷高效液相色谱质谱联用分析(LC-MS)具体方法:色谱条件:C18色谱柱 (IOOmmX 2. Imm);流动相:0· 1 % FA-乙腈,0-10min,5-95 % 乙腈;流速:0· 4mL/min ;柱温: 40°C,进样量10yL。质谱条件:电离源:电喷雾电离(ESI);检测模式:多反应监测;毛细 管电压:3kV ;脱溶剂气温度:400°C ;脱溶剂气流量:800L/h ;锥孔气流量:30L/h ;离子源温 度:350°C ;碰撞气流速0· 12mL/min。
[0072] (5)按此方法进行实验,结果发现,TLC板上菌株P1-A-19的转化液样品中出现了三 个斑点八(心值0. 31)、8〇^值0. 25)、以1^值0. 12),其中斑点C与10-DAB标准品的颜色和 比移值Rf相同。转化液样品的HPIX图在IO-DAB保留时间附近出现了明显的分离峰,可初 步判断转化液样品中含有10-DAB。而转化产物的TOF MS负离子谱图中又观察到分子量为 544. 2256的分离峰,正好比底物巴卡亭III少一个乙酰基,并与分子式为C29H36Oltl的10-DAB 分子量一致。
[0073] 综合TLC、HPLC、LC-MS分析的结果可知,分离株具有转化巴卡亭III生成10-DAB 的能力。
[0074] 10-DAB广泛分布于红豆杉植物的树叶、根、皮、枝干中。传统的提取方法需要多次 层析、梯度洗脱、多次重结晶后才能获得精制品。这不仅造成10-DAB的大量损失,降低了收 率,而且过程中还使用了大量易燃的石油醚和有毒性的乙腈,对环境造成不良影响。
[0075] 利用本发明提供的菌株能将巴卡亭III 一步转化生成10-DAB,该微生物转化过程 具有专一性高,副产物生成少,反应条件温和、环境友好等优点。
[0076] 本发明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19 的 16S rDNA测定的喊基序列; TTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC CGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGAC ATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTAC TCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGA CCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACG ACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTA GGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGT TTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACC TCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGC GTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGA ATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCAAGCCTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATC TGACTTAACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGC TGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCACTAAGGTTATTAACCTTAACGCCTTCCTC CTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTG CAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGAC CAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCATGA GGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCAT CAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGA。
【主权项】
1. 一株解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19,其特征在于:菌株保藏编号:CGMCCNo. 10267,保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:中国北京市朝阳区北辰西路 1号院,保藏日期:2014年12月30日,分类号为:Raoultellaornithinolytica。
2. 根据权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19,其特征在于:所述菌株具有产电 能力。
3. 根据权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19,其特征在于:所述菌株含有或表 达C-IO脱乙酰基酶。
4. 根据权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19,其特征在于:所述菌株能将巴卡 亭III转化生成10-DAB。
5. -种具有产电能力和将巴卡亭III转化生成10-DAB的菌株的筛选方法,其特征在 于:步骤如下: ⑴富集 待筛选污泥浓缩间的污泥经过简单的淘洗和沉淀处理后,去掉底层无机化的沉淀物和 表层的清水,取中间含水率在95%左右的污泥作为接种物,和污泥营养液一起加入微生物 燃料电池的反应器中,连续运行10-20d,负载电阻两端的电压逐渐稳定,此时,阳极上形成 肉眼可见的厚的生物膜; (2) 分离纯化 用接种环将生物膜上的全部菌体刮下,悬浮于无菌水中制备成均匀的菌悬液,涂布在 葡萄糖作为碳源的PBBM固体培养基上,30°C厌氧培养3-5d,将长出的具有不同形态的单菌 落分别挑出,在上述相同的培养基和培养条件下进行反复的划线分离和纯化培养,最后得 到多个纯种的分离株,将其进行编号和命名; (3) 筛选 ① 将分离得到的菌株接种于阳极液I,得到的接种液注入微生物燃料电池的反应器中, 反应器与外电阻和数据采集装置连接好,室温下运行; ② 将收集得到的菌体经甲苯破碎处理后,投加底物巴卡亭III,37°C200r/min转化3d, 通过TLC、HPLC、LC-MS对转化产物进行鉴定。
6. 权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌P1-A-19用于微生物燃料电池中产电的应用。
7. 权利要求1所述的菌株在制作微生物燃料电池中的应用。
8. 权利要求1所述的菌株在制备10-DAB中的应用。
9. 权利要求1所述的菌株制备10-DAB的方法,其特征在于:将收集得到的菌株经甲苯 破碎处理后,投加底物巴卡亭111,30-401:,180-25017 /1^11转化3-8(1,获得10-0八8。
【专利摘要】本发明公开了一株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)P1-A-19,该菌株是从污水处理厂的污泥经过富集、分离、纯化和筛选得到的。其特征在于:所述菌株应用于微生物燃料电池中表现出产电能力,同时又具有将巴卡亭III转化生成10-脱乙酰巴卡亭III(10-DAB)的能力,菌株保藏编号:CGMCC No.10267。本发明对于丰富产电微生物的多样性,挖掘更多具有高电化学活性的微生物菌种具有重要意义;同时也进一步拓宽了用于10-DAB生物合成的微生物菌株,为开发新的紫杉烷化合物的合成途径提供了新材料和新方法。CGMCC No.1026720141230
【IPC分类】C12P17-02, C12R1-01, C12N1-20, C12Q1-04, H01M8-16
【公开号】CN104726369
【申请号】CN201510083258
【发明人】骆健美, 朱凤芝, 周明华, 王敏
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月16日
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网友询问留言 已有2条留言
  • 访客 来自[德国] 2019年12月27日 21:07
    紧急求助!!15526793433本人哥哥因患糖尿病足在一个月前做了微创  球囊介入手术,但术后疼痛难忍,于半月前重新入院做脚趾头截肢手术,术后仍疼痛难忍,发烧,红肿,流血水,伤口不愈合,经医院做细菌培养后得到结果是,感染了一种中国及其罕见的(解鸟氨酸拉乌尔菌)!!现火速求助治疗此病的最佳方案!可直接加我微信。电话:15526793433王先生
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  • 访客 来自[德国] 2019年12月27日 21:04
    紧急求助!!本人哥哥因患糖尿病足在一个月前做了微创  球囊介入手术,但术后疼痛难忍,于半月前重新入院做脚趾头截肢手术,术后仍疼痛难忍,发烧,红肿,流血水,伤口不愈合,经医院做细菌培养后得到结果是,感染了一种中国及其罕见的(解鸟氨酸拉乌尔菌)!!现火速求助治疗此病的最佳方案!
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