一种稻米糊化温度调控基因的分子标记和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术领域，更具体地，涉及一种稻米糊化温度调控基因的分子标记和应用。
【背景技术】
[0002]水稻是我国重要的农作物，稻米品质直接关系到水稻生产的经济效益和人民的生活质量。糊化温度是稻米中的淀粉粒在热水中吸水失去结晶性而不可逆转地膨胀，形成淀粉糊时的温度，它与稻米中的淀粉的物理特性密切相关，是稻米蒸煮品质至关重要的衡量指标。传统的对稻米糊化温度性状的选择方法，往往是通过生化手段测定间接地对稻米品质进行选择，这种方法存在周期长、效率低、准确性较差等缺点。
[0003]可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase，SSS)是控制水稻支链淀粉生物合成的关键酶之一。编码可溶性淀粉合酶II的SSJJa基因，是控制稻米糊化温度的主效基因。发明人通过研宄分析不同类型水稻品种SSJJa基因序列多样性，发现第8外显子中SNP变异(GC/TT)与糊化温度的变异显著相关，能将高或中等糊化温度的水稻品种与低糊化温度的水稻品种区分开。
[0004]目前对于SNP的检测技术主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、裂解扩增多态性序列分析(cleaved amplified polymorphic sequence analysis，CAPS)、寡核苷酸连接分析(OLA)等方法。但由于这些标记稳定性、检测效率具有较大的局限性，例如CAPS需进行PCR扩增、酶切、电泳分离酶切片段，造成检测费时且成本较高，难以满足大规模分子育种需求。
[0005]四引物扩增受阻突变体系PCR (ARMS-PCR)能够针对SNP位点进行特异等位扩增。针对已知的变异位点，于两侧分别设计I对外引物和I对特异性内引物，特异性内引物3’末端碱基必须落在突变点的位置上，从而选择性地扩增突变型与野生型个体基因。在同一次扩增中野生型和突变型基因产生的扩增片段长度不同，通过产物片段分离中特定条带的有无可判别个体的基因型，是一种共显性分型技术，具有操作简便、分型快速、费用低廉等优势。
[0006]分子标记的快速、准确、高效检测方法是提高育种效率的有力工具，全自动毛细管电泳具备高分辨率、高敏感性、高通量和自动化的优势，结合SNP位点的特异等位扩增，能够实现批量化、自动化、快速的基因型检测，在作物种质资源基因分型和群体分子标记辅助育种上具有巨大应用潜力。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有鉴别水稻的稻米糊化温度的技术所存在的上述缺陷，提供一种鉴定稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型的分子标记。
[0008]本发明的第二个目的是提供上述分子标记在鉴定稻米糊化温度调控基因SSIIa基因型和/或稻米糊化温度中的应用。
[0009]本发明的第三个目的是提供上述分子标记在水稻育种中的应用。
[0010]本发明的第四个目的是提供利用上述分子标记鉴定稻米糊化温度调控基因SSIIa基因型的方法。
[0011]本发明的第五个目的是提供利用上述分子标记鉴定稻米糊化温度或同时鉴定稻米糊化温度和稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型的方法。
[0012]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种稻米糊化温度调控基因的分子标记SSIIa-GC/TT，所述分子标记SSIIa_GC/TT由一对外引物SSIIa-0-F、SSIIa-O-R和一对内引物SSIIa-F-GC、SSIIa-R-TT组成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]发明人通过对稻米糊化温度调控基因SSJJa在不同水稻品种中的等位基因序列比较，在低糊化温度水稻品种和高糊化温度水稻品种的SSJJa基因编码区第8外显子找到碱基序列上两个连续的SNP组成的GC/TT变异，设计涵盖差异位点的功能标记SSIIa-GC/TT0
[0014]本发明所述SSIIa-F-GC和SSIIa-R-TT的3’端第3个碱基引入错配碱基。
[0015]提供上述分子标记在鉴定稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型和/或稻米糊化温度中的应用。
[0016]提供上述分子标记在水稻育种中的应用。
[0017]提供利用上述分子标记鉴定稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型的方法；具体地，该方法包括以下步骤:
SI待测样品DNA提取；
S2以SI得到的样品DNA为模板，构建PCR反应体系，利用所述分子标记进行PCR扩增；
S3利用凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增后的产物，进行结果判定，所述结果判定为:若出现192bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJTa为高糊化温度基因型；若出现144bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJTa为低糊化温度基因型；若出现144bp、192bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJJa为杂合型。
[0018]提供利用上述分子标记鉴定稻米糊化温度或同时鉴定稻米糊化温度和稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型的方法，具体地，该方法包括以下步骤:
SI待测样品DNA提取；
S2以SI得到的样品DNA为模板，构建PCR反应体系，利用所述分子标记进行PCR扩增；
S3利用凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增后的产物，进行结果判定，所述结果判定为:若出现192bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJTa为高糊化温度基因型，待测样品为高糊化温度品种；若出现144bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJJa为低糊化温度基因型，待测样品为低糊化温度品种；若出现144bp、192bp和293bp条带，则表明待测样品的糊化温度调控基因SSJTa为杂合型，待测样品为中间糊化温度品种。
[0019]优选地，上述方法中，所述PCR反应体系为:DNA模板1.0 uL, SSIIa-Q-F 0.3uL、SSIIa-O-R 0.3uL、SSIIa-F-GC 0.3uL、SSIIa-R-TT 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix
7.5uL，用双蒸灭菌水补足至15uL。
[0020]优选地，上述方法中，所述PCR扩增的条件为:94°C预变性5min，94°C 30s，57°C30s，72°C 35s共运行35个循环，最后72°C延伸1min。
[0021]进一步地，发明人通过实验研宄发现，必须同时使用SSIIa-GC/TT标记中的4条引物才能得到准确检测水稻稻米糊化温度和/或稻米糊化温度调控基因SSJJa的基因型。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明基于ARMS-PCR原理，设计了一种鉴定稻米糊化温度调控基因SSJJa基因型的分子标记，该标记扩增片段适中、特异性强；利用该标记仅仅通过简单的PCR，可对稻米糊化温度调控基因SSJJa进行基因分型，区分高或中等糊化温度的水稻品种与低糊化温度的水稻品种，利用该标记可提高检测SSJJa基因型的效率，实现对水稻稻米糊化温度的分子标记辅助选择，本发明所述分子标记可以用于水稻改良分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。
【附图说明】
[0023]图1为SSIIa-GC/TT引物设计示意图；其中等位变异位点分别以红色背景标识，引物错配碱基以下划线标识。
[0024]图2为SSIIa-GC/TT扩增产物的凝胶电泳分型；其中，1:珍汕97B ；2:粵丰新占；3:珍汕97B/粵丰新占；4:明恢63 ；5:9311 ；6:Y华农B。
[0025]图3为SSIIa-GC/TT联合全自动毛细管电泳检测结果；其中M为DNA ladder ;1?
47为检测水稻材料，1_3、6、8、10、12 ?13、15、17_19、21、27、29、32 ?34、36、38、41 ?42:CG/CG 型;4，7、9、14、16、20、22-26、28、30 ?31、35、37、39 ?40,43 ?47:TT/TT 型;5、11:CG/TT 型。
【具体实施方式】
[0026]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027]实施例1水稻SSJTa基因功能性标记SSIIa-GC/TT的引物设计及扩增片段分析
1、引物设计
通过对水稻糊化温度调控基因SSJJa在不同水稻品种中的等位基因序列比较，低糊化温度水稻品种和高糊化温度水稻品种的SSJJa基因编码区第8外显子找到碱基序列上两个连续的SNP组成的GC/TT变异，设计涵盖差异位点的功能标记SSIIa-GC/TT，同时在等位特异引物的3’端第3个碱基引入错配碱基，增加特异性(图1)。所述的SSIIa-GC/TT由4个引物 SSIIa-0-F、SSIIa-O-R, SSIIa-F-GC 和 SSIIa-R-TT 构成，引物序列(5’ -3’ )如下:
SSIIa-O-F:CGTTCGACCCGTTCGAGGACACSSIIa-O-R:GCCAAGCTTCTTCAGGGAGGCTASSIIa-F-GC:AAGTACAAGGAGAGCTGGAGGGTGCSSIIa-R-TT:ACATGCCGCGCACCTGGGAA
(引物序列中带下划线的碱基为引入的错配碱基，加框的碱基为要检测的变异碱基)
2、扩增片段分析
高糊化温度(CG/CG纯合型)、低糊化温度(TT/TT纯合型)和杂合型(CG/TT杂合型)，都能利用SSIIa-O-F和SSIIa-O-R扩增出大小约为293 bp的条带，此带可以用于PCR扩增与否的监测。此外，高糊化温度(CG/CG纯合型)还能利用SSIIa-F-GC和SSIIa-O-R扩增出一条192 bp的条带；低糊化温度(TT/TT纯化型)能利用SSIIa-O-F和SSIIa-R-TT扩增出一条144 bp的条带；杂合型(CG/TT杂合型)既能扩增出192 bp的条带又能扩增出144 bp的条带。
[0028]实施例2利用分子标记SSIIa-GC/TT检测6个水稻品种糊化温度调控基因的基因型
1、水稻基因组DNA的提取
以6个水稻品种为材料:珍汕97B、明恢63、Y华农B、9311、粵丰新占和珍汕