用于樱桃病毒检测的多重rt-pcr试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于樱桃病毒检测的多重RT-PCR试剂 盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 由于栽培樱桃有较高经济效益，近几年樱桃的栽培在我国各地发展较快。我国的 大樱桃栽培主要集中在山东的烟台，辽宁的大连，河北的秦皇岛等地，目前北京、山西、江 苏、安徽、河南、甘肃、新疆等地均有栽培种植。但近年来，病毒病呈日益加重的趋势，成为 影响樱桃产量和品质的重要因素。据国外报道，侵染大樱桃的病毒约有30多种，比较常 见的大樱桃病毒主要有20种。我国已报道的侵染樱桃的主要病毒有：李属坏死环斑病毒 (Prunusnecroticringspotvirus，PNRSV)，李矮缩病毒（Prunedwarfvirus，PDV)，楼 桃病毒A(CherryvirusA，CVA)，楼桃绿环斑驳病毒（Cherrygreenringmottlevirus， CGRMV)，楼桃小果病毒一 2(Littlecherryvirus-2，LChV-2)，楼桃小果病毒 _1(Little cherryvirus-l，LChV_l)，苹果裡绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV) 等。
[0003] 发明人在2014年4-10月对我国山东，辽宁和北京樱桃园的35个样品病毒进了常 规的RT-PCR检测，结果表明CVA与CGRMV,CGRMV与LChV-1,CVA与ACLSV,CGRMV,LChV-1 存 在复合侵染现象（部分结果已发表在卢美光，吴冰，高蕊，等.我国部分地区樱桃病毒病害 初步调查和病原检测.植物保护，2015, 41 (1) :98-103.)，未检测到CNRMV。有必要研宄可以 同时鉴别检测这四种樱桃病毒的快速检测手段。
[0004] 关于樱桃病毒检测的现有技术，目前国内外已有3篇关于樱桃病毒多重 RT-PCR报道，包括同时检测樱桃CVA,PNRSV，CNRMV，LChV-1四种病毒，同时检测樱桃 PNRSV，PDV，LChV-2,CGRMV四种病毒和同时检测樱桃PNRSV，PDV，LChV-2三种病毒的报道， 其中对CVA,PNRSV，CNRMV，LChV-1四种病毒的多重RT-PCR的报道是基于室内对四种病毒人 工混合进行的研宄，没有这四种病毒混合感染的田间样品。
[0005] RT-PCR检测方法是樱桃病毒检测的重要和常用的技术。多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR，mRT-PCR)是PCR技术的发展，是对两个以上不同病毒基因位点的同时扩增，是一种 较为快速、简便、经济的检测方法，目前，已应用到多种植物病毒的检测。该方法用于樱桃病 毒复合感染的样品的检测是一种不错的选择。但对不同植物不同病毒组合的mRT-PCR检测 体系均各不相同，必须对引物进行筛选，对引物浓度，样品cDNA浓度及PCR体系进行优化才 能建立一套同时扩增多病毒基因的稳定的检测方法。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域存在的不足，本发明提供一种可同时检测侵染樱桃的 CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1四种病毒的多重RT-PCR检测方法及其试剂盒。本发明请求保护 的技术方案如下：
[0007] 用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一 起的如下的四对引物：
[0008] CVA-F: 5 ' -TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3 '，
[0009] CVA-R:5' -TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3' ；
[0010] ACLSV-F: 5 ' -TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3 '，
[0011] ACLSV-R: 5 ' -GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3 ' ；
[0012] CGRMV-F: 5 ' -AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3 '，
[0013] CGRMV-R:5' -GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3' ；
[0014]LChV-lF:5' -GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3'，
[0015] LChV-lR:5' -GGCTTGGTTCCATACACTTC-3'。
[0016] 所述樱桃病毒为CVA，ACLSV，CGRMV和 / 或LChV-1。
[0017] 所述多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述四对引物，四对引物的 摩尔比为：CVA:ACLSV:CGRMV:LChV-l= 1 :11. 25 :0? 5 :10。
[0018] 用于检测樱桃病毒CVA的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引 物：
[0019] CVA-F: 5 ' -TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3 '，
[0020] CVA-R: 5，-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3，。
[0021] 用于检测樱桃病毒CGRMV的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的 引物：
[0022] CGRMV-F: 5 ' -AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3 '，
[0023] CGRMV-R: 5 ' -GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3 '。
[0024] 还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
[0025] nad5-F: 5 ' -GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3 '，
[0026] nad5-R: 5，-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3，。
[0027] 还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
[0028] nad5-F: 5 ' -GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3 '，
[0029] nad5-R:5, -CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3,；
[0030] 五对引物的摩尔比为：CVA:ACLSV:CGRMV:LChV-l:nad5 = 1 :11. 25 :0? 5 :10 : 1. 125〇
[0031] 用于检测樱桃病毒的mRT-PCR方法，包括如下步骤：
[0032] (1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；
[0033] (2)采用权利要求1或2所述的试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多 重PCR反应，得到扩增产物；
[0034] (3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现1184bp大小的条带，则样 品中含有CVA;若扩增产物中出现791bp大小的条带，则样品中含有ACLSV;若扩增产物中 出现468bp大小的条带，则样品中含有CGRMV;若扩增产物中出现300bp大小的条带，则样 品中含有LChV-1。
[0035] 所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CVA-F/ R0. 08yM,ACLSV-F/R0. 9yM,CGRMV-F/R0. 04yM,LChV-lF/R0. 8yM〇
[0036] 所述PCR反应的退火温度为55°C。
[0037] 所述PCR反应的条件为：94°C预变性5min;94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C 延伸40sec，循环35次；最后72°C延伸lOmin。
[0038] 本发明提供能同时检测CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1四种病毒的PCR试剂盒，包括四 对引物：CVA-F/R，ACLSV-F/R，CGRMV-F/R，LChV-lF/R，能够分别特异结合四种病毒的RNA反 转录成的cDNA，准确检测待测植株是否感染这四种病毒之一、之二、之三或全部。所述试剂 盒还可以包括植物内参对照基因引物nad5-F/R，它是植物mRNA特异引物，用于检测提取的 植物RNA的质量和RT-PCR的效果，从而排除因操作不规范或其它原因导致的假阴性结果。
[0039] 本发明还提供能同时检测CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1四种病毒的mRT-PCR检测方 法。所述方法快速、简便、经济、稳定，只需提取待测植株的总RNA，反转录获得cDNA，然后 采用本发明提供的引物组合，以cDNA为模板进行PCR反应，最后利用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，根据产物大小，即可判断待测植株是否感染这四种病毒，操作简便易行，一份样品 只需一次PCR即可对四种病毒进行检测，减少了操作次数，避免了交叉污染，同时还减少了 试剂、引物、模板及耗材等的使用量，节约了时间，达到了简便、经济、快速和准确的检测要 求。应用该方法对我国山东、辽宁和北京樱桃样品进行这四种病毒的检测，结果表明，与单 重PCR检测结果一致。
[0040] 多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个位点，多个基因片断的特异性扩 增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物 种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩 增；引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无 法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。使用本发明提 供的PCR试剂盒进行多重PCR检测待测植株是否感染CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1病毒，优选 引物配比为CVA-F/R:ACLSV-F/R:CGRMV-F/R:LChV-lF/R= 1 :11. 25 :0? 5 :10,如使用植物 内参对照基因引物nad5-F/R，优选引物配比为CVA-F/R:ACLSV-F/R:CGRMV-F/R:LChV-lF/ R:nad5-F/R= 1 :11. 25 :0. 5 :10 :1. 125。本发明提供的引物组合及其引物配比，能够保证 四种病毒的靶标条带均得到有效扩增，并且特异性强，检测结果的准确性高。
[0041] 此外，其它PCR反应条件如循环退火温度，模板浓度，体系体积等也直接影响产物 的扩增。本发明提供的检测方法，多重PCR反应的退火温度优选55°C。该方法能够检测 CVA，ACLSV，CGRMV和LChV-1病毒的RNA(~0. 471ug/yL)的极限稀释倍数为53,能够检测 CVA，ACLSV和CGRMV病毒的cDNA(RNA~0. 732ug/yL的反转录产物）的极限稀释倍数为 54,灵敏度高。对PCR反应体积的研宄表明，50ul、30ul、25ul的体系均可用于这四种病毒的 多重PCR扩增，从经济的角度和操作的简易性考虑，25ul的体系最佳。
[0042] 本发明提供的能同时检测CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1四种病毒的引物组合及 mRT-PCR检测方法，具有很强的实用性。利用本发明，对我们单重RT-PCR已检测到的辽 宁大连、山东烟台和北京3个地区的20份樱桃阳性样品和4份阴性样品进行四种病毒 检测。结果表明多重RT-PCR检测结果与单重RT-PCR检测结果一致。不仅检测到单一 CVA,CGRMV,LChV-1 感染；而且检测到CVA与CGRMV,CGRMV与LChV-1,CVA