与ACLSV、CGRMV、 LChV-1复合感染。因此，采用本发明提供的PCR试剂盒及mRT-PCR检测方法，能够快速、准 确地检测田间常见的樱桃病毒感染，及时提供预防和治理方案，将病毒感染所带来的经济 损失降至最低。
[0043] 术语：
[0044] 为了与多重RT-PCR区别，全文将普通RT-PCR命名为单重RT-PCR，普通PCR命名为 单重PCR。
【附图说明】
[0045] 图1不同引物组合PCR筛选琼脂糖凝胶电泳检测图，
[0046] 其中，M:AL2000DNAMarker，N:阴性对照。
[0047] 图2不同组合引物浓度和配比的琼脂糖凝胶电泳检测图。
[0048] 图3不同退火温度对mRT-PCR的影响。
[0049] 图4不同RNA浓度对mRT-PCR检测敏感性测定影响。
[0050] 图5不同cDNA浓度对mRT-PCR检测敏感性测定影响。
[0051] 图6单重PCR与多重PCR病毒检测比较，
[0052] 其中，1-9为四种病毒CVA，ACLSV，CGRMV，LChV-1复合侵染的烟台樱桃叶片，1为多 重PCR产物，2~9为单重PCR产物。
[0053] 图7多重RT-PCR对田间样品的检测，
[0054] 其中，1，5,6,8，11，13，14，19,20为烟台樱桃叶片；2,3,9，15，16为北京樱桃叶片； 4, 7,17,18为大连樱桃枝条；10,12为大连樱桃叶片。
[0055] 图8多重RT-PCR对田间样品及PCR回收产物的检测，
[0056] 其中，21，22, 23为北京樱桃叶片；24为大连樱桃枝条LChV-IPCR回收产物；25为 烟台樱桃叶片ACLSVPCR回收产物；26为烟台樱桃叶片。
[0057] 图9多重RT-PCR四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1和nad5扩增片段的序列 BLAST结果。
【具体实施方式】
[0058] 以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要理解的是，下述实施例仅作为解释 和说明，不构成对本发明的任何限制。
[0059] 植物材料
[0060] 24个有病害症状和无症状樱桃叶片和枝条样品于2014年4~10月采自山东烟 台、辽宁大连和北京，其中，四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1复合侵染材料采自山东烟 台果园。
[0061] 主要试剂和仪器
[0062] 多糖多酷植物总RNA提取试剂盒（Polysaccharides&Polyphenolics-rich RNAprepPure)购自天根生物技术（北京）公司）；
[0063] AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen试剂公司；
[0064] dNTPMix(lOmM), 5XM-MLVbuffer,M-MLVRT(200U/y1),RNaseinhibitor(40U/ ul)，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司（PR0MEGA);
[0065] 2XTaqPCRmix，购自北京冰达生物技术有限公司；
[0066] MultiGeneOptiMaxThermalCyclerTC9610-230(Labnet International,Inc.)；
[0067] Bio-RadPCR仪；
[0068] KCBI0-2800凝胶成像系统；
[0069] 中国DYY-6B型稳压电泳仪。
[0070] 实施例1?多重RT-PCR反应体系的建立
[0071] 1、引物设计与合成
[0072] 根据文献"宗晓娟，王文文，王甲威，等.SYBRGreenI实时定量RT-PCR技术在 甜樱桃病毒定量分析中的应用[J].植物保护学报，2012, 39(6) :497-502."中所述的引物 CVA-1 ；
[0073] aYuY,ZhaoZ,JiangD,etal.Aone-stepmultiplexRT-PCRassayfor simultaneousdetectionoffourvirusesthatinfectpeach[J].LettAppl Microbiol, 2013, 57 (4) :350-355. " 中所述的引物ACLSV-1 ;
[0074] ^BajetNB,UnruhTR,DruffelKL,etal.Occurrenceoftwolittlecherry virusesinsweetcherryinWashingtonState[J].PlantDisease, 2008,92 ：234 -238. "中所述的引物LChV-1 ;
[0075] "卢美光，吴冰，高蕊，等.我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测.植物 保护[J].，2015, 41 (1) :98-103.) " 中所述的引物ACLSV-2,CGRMV-1 ;
[0076]以及"MenzelW.，JelkmannW.，MaissE.Detectionoffourapplevirusesby multiplexRT-PCRassayswithcoamplificationofplantmRNAasinternalcontrol. J.Virol.Methods, 2002, 99 :81 - 92. " 中所述的引物nad5。
[0077] 应用Primer3. 0引物软件设计樱桃病毒的特异引物CVA-2,CGRMV-2。nad5为植 物内参对照基因引物（植物mRNA特异引物），用于检测提取的植物RNA的质量和RT-PCR的 效果。为了保证这四种病原能够在同一个反应体系和相同温度下同时被检测出来，在设计 引物时，选择Tm值接近的引物对，并对引物对进行比对，保证引物对的3'端无互补性。详 细的病毒特异引物序列和植物mRNA特异引物序列见表1，所有的引物由北京六合华大基因 科技股份有限公司合成。
[0078] 表1.PCR反应所用特异性引物
[0079]
【主权项】
1. 用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起 的如下的四对引物： CVA-F :5' -TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3'， CVA-R :5' -TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3' ； ACLSV-F :5' -TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3'， ACLSV-R :5' -GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3' ； CGRMV-F :5' -AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3'， CGRMV-R :5' -GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3' ； LChV-IF :5' -GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3'， LChV-IR :5' -GGCTTGGTTCCATACACTTC-3'。 所述樱桃病毒为CVA，ACLSV，CGRMV和/或LChV-I。
2. 根据权利要求1所述的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述四对 引物，四对引物的摩尔比为：CVA :ACLSV :CGRMV :LChV-l = I :1L 25 :0· 5 :10。
3. 用于检测樱桃病毒CVA的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引 物： CVA-F :5' -TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3'， CVA-R :5' -TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3'。
4. 用于检测樱桃病毒CGRMV的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的 引物： CGRMV-F :5' -AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3'， CGRMV-R :5' -GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3'。
5. 根据权利要求1、3和4任一所述的试剂盒，还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息 如下： nad5-F :5' -GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3'， nad5-R :5' -CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3'。
6. 根据权利要求2所述的试剂盒，还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下： nad5-F :5' -GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3'， nad5-R:5' -CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3' ； 五对引物的摩尔比为：CVA :ACLSV :CGRMV :LChV-l :nad5 = I :11. 25 :0· 5 :10 :1. 125〇
7. 用于检测樱桃病毒的mRT-PCR方法，包括如下步骤： (1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板； ⑵采用权利要求1或2所述的试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR 反应，得到扩增产物； (3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现1184bp大小的条带，则样品中 含有CVA ;若扩增产物中出现791bp大小的条带，则样品中含有ACLSV ;若扩增产物中出现 468bp大小的条带，则样品中含有CGRMV ;若扩增产物中出现300bp大小的条带，则样品中含 有 LChV-I0
8. 根据权利要求7所述的方法，所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系 中的终浓度分别为 CVA-F/R 0· 08 μ M, ACLSV-F/R 0· 9 μ M, CGRMV-F/R 0· 04 μ M, LChV-lF/R 0· 8 μΜο
9. 根据权利要求8所述的方法，所述PCR反应的退火温度为55°C。
10. 根据权利要求9所述的方法，所述PCR反应的条件为：94°C预变性5min ;94°C变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C延伸 40sec，循环 35 次；最后 72°C延伸 IOmin0
【专利摘要】本发明涉及“用于樱桃病毒检测的多重RT-PCR试剂盒及检测方法”，属于植物病毒检测领域。本发明提供的多重PCR试剂盒，包含独立包装或者混装在一起的四对引物：CVA-F/R,ACLSV-F/R,CGRMV-F/R以及LChV-1F/R，所述樱桃病毒为CVA,ACLSV,CGRMV和/或LChV-1。采用本发明试剂盒检测这四种樱桃病毒，灵敏度高：只需提取待测樱桃植株的叶片或韧皮部的总RNA(低至2ng)，反转录成cDNA，按照引物摩尔比CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10进行PCR反应，即可检测出待测样品中是否含有这四种病毒中的一种、两种、三种或全部；特异性强：对检测的病毒基因片段进行测序，结果表明，四个病毒基因片段均为目的片段。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104831000
【申请号】CN201510280319
【发明人】卢美光, 李世访, 高蕊, 张志想, 吴冰
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月27日