G-CSF、GM-CSF、干扰素、白介素因子（interleukin factors)、VEGF 受体、TNF a 受体、 RANK、生长激素、促红细胞生成素、凝血因子（blood-coagulation factors)、单链Fv、单域 抗体（single domain antibodies)及其功能性变体。
[0030] 在一些实施方式中，所述治疗性多肽通过人源的蛋白连接部分与pCloud序列连 接。在【具体实施方式】中，所述蛋白连接部分为具有细长形状的蛋白质序列，例如人纤连蛋白 III型结构域。
[0031] 在本发明的【具体实施方式】中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含：治疗性多肽， 其选自 GLP-1、GLP-1 (A8G/G22E)、GLP-1 (A8G/G22E/R36G)和 GLP-1 (A8G/G22E/R36S)所组成 的组；柔性环；蛋白连接部分，其选自Fn7、Fn8和TNCfn3所组成的组；pCloud序列；以及支 架蛋白，其选自〇^18%1、〇^15从：1、〇^19从：2和4〇^30(：19样结构域所组成的组。
[0032] 在本发明的优选实施方式中，本发明的融合蛋白从N端到C端包含：GLP_1(A8G/ G22E/R36G)、柔性环、Fn8、pCloud 序列和 C0L18NC1。
[0033] 在本发明的另一优选实施方式中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含：第一 pCloud序列、人生长激素、第二pCloud序列和C0L18NC1。
[0034] 本发明还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸序列、包含所述融合蛋白和可药用 载体的药物组合物、以及包含所述多核苷酸序列和表达控制元件的表达载体。
[0035] 本发明在另一方面提供了改善治疗性多肽的药代动力学性质的方法，其包含步 骤：将所述治疗性多肽融合至一个或多个pCloud多肽及三聚体支架蛋白。在一些实施方式 中，所述治疗性多肽通过人源的蛋白连接部分与所述pCloud序列连接。本发明的融合蛋白 具有以下性质：(a)连结至所述支架蛋白及一个或多个pCloud序列的所述治疗性多肽的终 末半衰期相较所述治疗性多肽自身的终末半衰期显著延长；(b)连结至所述支架蛋白及一 个或多个pCloud序列的所述治疗性多肽在生理条件下的稳定性和溶解度相较所述治疗性 多肽自身的稳定性和溶解度得到改善。
【附图说明】
[0036] 图1所示为本发明部分机理的示意图。治疗性多肽在图la和图lc中示为红星， 在图lb中示为红色螺旋。a)该治疗性多肽直接连接至pCloud多肽和支架蛋白。b)该治 疗性多肽通过人源的蛋白连接部分与pCloud多肽及支架蛋白融合，所述蛋白连接部分优 选为具有细长形状的蛋白质序列。c)该治疗性多肽和该pCloud多肽可以融合在该支架蛋 白的相对的两端。
[0037] 图2成熟人纤维蛋白原a链的氨基酸序列。纤维蛋白原a链的氨基酸残基编号 被列出。主要含有甘氨酸（G)、丝氨酸（S)和谷氨酸（E)、脯氨酸（P)、精氨酸（R)和苏氨酸 (T)残基的12条非结构性片段带有下划线。为进一步降低这些片段的免疫原性，引入突变 Y277S、V379A 和 D396E。Y277、V379 和 D396 残基为粗体。
[0038] 图3所示为使用分析柱Superdex200 (GE Healthcare)进行的经纯化的 GLP-1 (A8G/G22E/R36S)-Fn8-C0L18NCl、GLP-1 (A8G/G22E/R36S)-Fn8-⑶L18NC1-20、 GLP-1(A8G/G22E/R36S)-Fn8-C0L18NCl-30 和 GLP-1(A8G/G22E/R36S)-Fn8-C0L18NCl-54 的 凝胶过滤层析图谱。图中这些蛋白的图谱标为NC1、NC1-20、NC1-30和NC1-54。分子标记 蛋白（158Kd、67Kd和44Kd)的洗脱时间用箭头表示。X轴系指洗脱时间，Y轴系指UV280吸 光强度。
[0039] 图4所示为通过使用夹心ELISA法测定的Sprague Dawley大鼠中含有GLP-1的 蛋白（GLP-1 (A8G/G22E/R36S) -Fn8-C0L18NC1、GLP-1 (A8G/G22E/R36S) -Fn8-C0L18NCl-20、 GLP-1 (A8G/G22E/R36S)-Fn8-C0L18NCl-30 和 GLP-1(A8G/G22E/R36S)-Fn8-C0L18NCl-54) 的药代动力学图谱。图中这些蛋白的图谱分别标为NC1、NC20、NC30和NC54。纵轴表示通 过使用夹心ELISA法测定的蛋白浓度与Cmax相比的百分比。
[0040] 图5所示为通过使用分析柱Superdex200 (GE Healthcare)进行的经纯化的 GLP-1-Fn8、GLP-1-Fn8-C0L 18NC1、GLP-1 (A8G/G22E/R36G) -Fn8-p246-C0L 18NC1 的凝胶过滤 层析图谱。图中这些蛋白的图谱被标出。分子标记蛋白的洗脱时间用箭头表示。X轴系指 洗脱时间，Y轴系指UV280吸光强度。
[0041] 图 6 所示为 GLP-1 (7-37)肽、GLP-1-Fn8-C0L18NC1 和 GLP1 (A8G/G22E/ R36G)-Fn8-p246-C0L18NCl的cAMP检测结果。该检测基于竞争性结合技术。cAMP的特异单 克隆抗体结合至包被于微孔板上的山羊抗小鼠抗体。其后洗涤以除去过量的单克隆抗体， 样本中存在的cAMP与既定量的辣根过氧化物酶（HRP)标记的cAMP竞争单克隆抗体位点。 此后再次洗涤以除去过量缀合物和未结合样本。加入底物溶液至孔中以测定结合酶活性。 停止显色，并在450nm处读取吸光度。颜色强度与样本中cAMP的浓度成反比。Y轴系指酶 标仪所获得的 〇D45Q值，X 轴系指 GLP-1 (7-37)肽、GLP-1-Fn8-C0L18NC1 和 GLP1 (A8G/G22E/ R36G)-Fn8-p246-C0L18NCl 的浓度。
[0042] 图 7 所示为融合蛋白 GLP-1-Fn8-C0L18NC1、GLP-1 (A8G/G22E/ R36G)-Fn8-p246-⑶L18NC1 和 GLP-l(A8G/G22E/R36G)-Fn8-p285-C0L18NCl 在 Sprague Dawley大鼠中的药代动力学图谱。血液样本中的蛋白质浓度通过使用夹心ELISA法测定。 图中这些蛋白质的图谱分别被标为NCl、p246和p285。由每组6只大鼠计算而来的误差线 被标出。
[0043] 图 8 所示为融合蛋白 GLP-1 (A8G/G22E/R36G)-Fn8-p246-C0L18NCl 在三只食蟹猴 中的药代动力学图谱。血清样本中的蛋白质浓度通过使用夹心ELISA法测定。图中三只食 蟹猴分别被标为#1、2和3。
[0044] 图 9 所示为 GLP1 (A8G/G22E/R36G) -Fn8-p246-C0L18NCl 在 SD 大鼠中的腹腔葡萄 糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)结果。图中 GLP1(A8G/ G22E/R36G)-Fn8-p246-C0L18NCl被标为p246。图9a中，大鼠分别被注射盐水10nmol/kg和 20nmol/kg剂量的 GLP1(A8G/G22E/R36G)-Fn8_p246-C0L18NC1。融合蛋白（和对照）给药后 8小时进行IPGTT实验。三条曲线分别表示接受阴性对照（盐水）、10nmol/kg和20nmol/kg 剂量 GLP1 (A8G/G22E/R36G)-Fn8-p246-C0L18NCl 的大鼠 IPGIT 葡萄糖水平。图 9b 中，对大 鼠注射盐水、20nmol/kg 剂量的 GLP1 (A8G/G22E/R36G) -Fn8-p246-C0L18NCl。融合蛋白（和 对照）给药后32小时和102小时进行IPGTT实验。三条曲线分别表示阴性对照（盐水）、 GLP1 (A8G/G22E/R36G) -Fn8-p246-C0L18NCl 给药后 32 小时和 102 小时的大鼠 IPGTT 葡萄糖 水平。
[0045] 定义
[0046] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文可互换使用，系指任意长度的氨基酸聚合 物。所述聚合物可以为线性的或支化的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基 酸中断。该术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物，譬如通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙 酰化、磷酸化或任何其他操作，例如与标记组分缀合。术语"柔性非结构性多肽"（flexible unstructured polypeptide)、"柔性非结构性多肽序列"（flexible unstructured polypeptide sequence)和"柔性非结构性接头"(flexible unstructured linker)、"柔性 非结构性多肽接头"(flexible unstructured polypeptide linker)在本发明中可互换使 用。所述柔性非结构性多肽序列含有1至3000个氨基酸残基，其中G、S、E、A、P和T合计 构成所述柔性非结构性多肽序列的超过90% ;并且据G0R算法测定，所述柔性非结构性多 肽序列具有大于90%的非结构性无规卷曲形成[10]。
[0047] 术语"pCloud"多肽的特征在于：（a)所述pCloud总氨基酸残基为至少100至约 3000个氨基酸残基；(b)所述pCloud多肽序列通过使用源自人纤维蛋白原a链的部分或 全部片段生成。在pCloud序