头的长度可以有效改变该 分子的流体力学半径和/或Rg，并控制该工程化蛋白质分子的体内半衰期。因此，通过改变 融合蛋白内柔性非结构性接头的长度，我们的方法可以生成体内半衰期可调的重组蛋白。 这与体内半衰期固定的传统治疗性IgG相比十分有利。此外，我们的"三叉戟技术"可以使 融合蛋白相对于配体具有三价，相比之下，IgG仅具有二价。
[0065]pCloud多狀
[0066] 本发明提供了包含"pCloud"多肽的组合物。在本发明的优选实施方式中，柔性非 结构性接头表现为一个或多个非结构性pCloud多肽。在一些实施方式中，pCloud多肽一 般是在生理条件下具有低程度或没有二级或三级结构的伸展多肽。
[0067] 所述pCloud序列的特征在于：（a)所述pCloud总氨基酸残基为至少100至约3000 个氨基酸残基；(b)所述pCloud多肽序列是通过使用源自人纤维蛋白原a链的部分或全 部片段生成。在pCloud序列中，纤维蛋白原片段两侧为长度多样的柔性环。因此pCloud 主要是人源的，对人给药时具有低免疫原性。（c)所述pCloud序列富含甘氨酸（G)、丝氨酸 (S)和谷氨酸（E)。所述pCloud还含有丙氨酸（A)、脯氨酸（P)、精氨酸（R)和苏氨酸（T)。 G、S、E、A、P和T合计构成所述pCloud序列的超过90%。（d)据G0R算法测定，所述pCloud 序列具有大于90%的非结构性无规卷曲形成[10];以及（e)据TEPIT0PE算法预测，所述 pCloud序列不含任何T细胞表位[12]。
[0068] 现已报道，将非结构性多肽融合至治疗性多肽可以显著延长该治疗性多肽的体内 半衰期（XTEN技术）[13]。然而在XTEN技术中，非结构性多肽系使用人工肽片段生成，且 并未与三聚体支架蛋白融合。XTEN技术中的这些人工肽对人体而言意味着外源肽，这些外 源肽在给药时很可能在患者体内引发免疫应答。因为许多治疗性多肽，例如人生长激素和 GLP-1类似物，需要对患者长期施用，所以XTEN技术引入的外源肽对患者而言可能意味着 潜在威胁。本发明中，通过使用人纤维蛋白原a链序列生成的柔性非结构性"pCloud"多 肽被证明能有效延长治疗性多肽的体内半衰期。此外，本发明中，pCloud多肽进一步与三 聚体支架蛋白融合，这进一步改善了该治疗性多肽的药代动力学性质。
[0069] 在本发明的一些实施方式中，为了构造具有低免疫原性的非结构性pCloud多肽， 我们利用了人纤维蛋白原a链序列。人纤维蛋白原（因子I)为可溶的、340kDa的血浆糖 蛋白，其在血凝块形成过程中由凝血酶转化成纤维蛋白[14-16]。纤维蛋白原由肝细胞在肝 脏中合成。人体血浆中纤维蛋白原的正常浓度是相当高的（1.5-3mg/ml)，这有力地表明， 人纤维蛋白原序列可能表现出非常低的免疫原性。人纤维蛋白原是含有两组各三个不同链 (a、0、Y)的异源六聚物，各链通过二硫键彼此连结。纤维蛋白原a链内存在固有的非 结构区（残基262-455)(图2)。据G0R算法测定，纤维蛋白原的这一非结构区含有最少的 二级结构[10，17]。经鉴定，这一纤维蛋白原非结构区（残基262-455)内的12条片段主要 含甘氨酸（G)、丝氨酸⑶和谷氨酸（E)、脯氨酸（P)、精氨酸（R)和苏氨酸⑴残基。在本 发明的一些实施方式中，为进一步减少这些片段的免疫原性，分别将突变Y277S、V379A和 D396E引入片段1、9和11中（图2)。在一些实施方式中，将获得的源自人纤维蛋白原a 链序列的12条片段用作生成pCloud多肽的构件（表1)。在一些实施方式中，与表1中所 列片段具有至少70%、75%、80%、85%或90%氨基酸序列同一性的这些片段的变体可用 作pCloud多肽的构件。
[0070] 表1源自人纤维蛋白原a链的12条片段的蛋白质序列
【主权项】
1. 融合蛋白，其包含融合至一个或多个柔性非结构性多肽接头和支架蛋白的治疗性 多肽，其中所述支架蛋白在溶液中形成同源三聚体，所述柔性非结构性多肽接头含有1至 3000个氨基酸残基，其中G、S、E、A、P和T合计构成所述柔性非结构性多肽序列的超过 90 %，且根据GOR算法测定，所述柔性非结构性多肽序列具有超过90 %的非结构性无规卷 曲形成，其中所述融合蛋白在对受试者给药时相较所述治疗性多肽单独给药表现出改善的 药代动力学性质。
2. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N端至C端按下述公式构造： (接头）m_ TP -(接头）n-支架-(接头）k或 (接头）m_支架_ (接头）n_ TP -(接头）k 其中： (a) 接头为权利要求1中所表征的所述柔性非结构性多肽接头； (b) TP为治疗性多肽，其选自但不限于由：人胰高血糖素样肽-I (GLP-I)、艾塞那肽 (Exenatide)、GLP-2、C肽、降钙素、人甲状旁腺激素（PTH)、胰高血糖素、G-CSF、GM-CSF、干 扰素、白介素因子、VEFG受体、TNF a受体、RANK、生长激素、促红细胞生成素、凝血因子、单 链Fv、单域抗体及其功能性变体所组成的组； (c) 支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体； (d) m为0或l;n为0或l，k为0或1，且m+n+k> = 1 ;其中所述数字表示所标明的多 肽的存在数量。
3. 融合蛋白，其包含融合至一个或多个柔性非结构性多肽接头和三聚体支架蛋白的治 疗性多肽，其中所述融合蛋白内，所述治疗性多肽经由人源的蛋白连接部分被连接至所述 柔性非结构性多肽序列，其中所述融合蛋白在对受试者给药时相较所述治疗性多肽单独给 药表现出改善的药代动力学性质。
4. 权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N端至C端根据下述公式构造： (接头）m _ TP -环-PCM -(接头）n -支架-(接头）k或 (接头）m-支架_ (接头）n-PCM -环-TP-(接头）k 其中： (a) 接头为权利要求1中所表征的所述柔性非结构性多肽接头； (b) TP为治疗性多肽，选自但不限于由人胰高血糖素样肽-I(GLP-I)、艾塞那肽 (Exenatide)、GLP-2、C肽、降钙素、人甲状旁腺激素（PTH)、胰高血糖素、G-CSF、GM-CSF、干 扰素、白介素因子、VEFG受体、TNF a受体、RANK、生长激素、促红细胞生成素、凝血因子、单 链Fv、单域抗体及其功能性变体所组成的组； (c) 支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体； (d) m为0或l;n为0或l，k为0或1，且m+n+k> = 1 ;其中所述数字表示所标明的多 肽的存在数量； (e) PCM为所述人源蛋白连接部分；以及 (f) 环为柔性环，其中所述柔性环具有从〇到100个残基的可变长度，所述柔性环富含 甘氨酸（G)和丝氨酸（S)，所述柔性环还可以含有谷氨酸（E)、丙氨酸（A)、脯氨酸⑵和苏 氨酸（T)，且据GOR算法测定，所述柔性环具有多于95%的非结构性无规卷曲形成。
5. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述柔性非结构性多肽接头选自由以下 构成的组：（G2S)n、（G3S)n、（G4S)n、（G5S)n、（GS)n、（G2S2)n、（GS2)n、（GS3)n、（S2G)n、 (S3G)n、（S4G)n、（S5G)n、（SG)n、（S2G2)n、（SG2)n、（SG3)n(其中 n 为整数）、GGGSGGGG、 GGGSGGGGS、GSGG、GGGSGGG、GGGGSGGG、GGGSGG、GGGGSGG、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、 GGGGSGGGGSASSASTGGPSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSTASSASTGGPSGGGGSGGGGSAPSSGSTSGGTAAGG GGSGGGGS 和 GGGSGGGSGGGSTASSASTKGPSGGGSGGGSGGGSAPSSKSTSGGTAAGGGSGGGSGGGS。
6. 融合蛋白，其包含融合至一个或多个pCloud序列和支架蛋白的治疗性多肽，其中所 述支架蛋白在溶液中形成同源三聚体，所述PCloud序列为含有至少100至约3000个氨基 酸残基的柔性非结构性多肽，其中所述融合蛋白对受试者给药时相较所述治疗性多肽单独 给药表现出改善的药代动力学性质。
7. 权利要求6所述的融合蛋白，其中所述pCloud多肽的特征在于： (a)所述pCloud总氨基酸残基为至少100至约3000个氨基酸残基；(b)所述pCloud多 肽序列系通过使用源自人纤维蛋白原a链的部分或全部片段生成，且在pCloud序列中，所 述纤维蛋白原片段两侧为1至1〇〇个残基的长度多样的柔性环，因此所述pCloud多肽主要 是人源的，对人给药时具有低免疫原性；（c)所述pCloud序列富含甘氨酸（G)、丝氨酸（S) 和谷氨酸（E)，所述pCloud还含有丙氨酸（A)、脯氨酸（P)、精氨酸（R)和苏氨酸（T)，G、S、 E、A、P和T合计构成所述pCloud序列的超过90% ; (d)据GOR算法测定，所述pCloud序列 具有大于90%的非结构性无规卷曲形成；以及（e)据TEPIT0PE算法预测，所述pCloud序 列不含任何T细胞表位。
8. 权利要求6或7所述的融合蛋白，其中在pCloud序列中，所述人纤维蛋白原片段两 侧为0至100个残基的长度可变的柔性环，所述柔性环富含甘氨酸（G)和丝氨酸（S)，所述 柔性环还可含谷氨酸（E)、丙氨酸（A)、脯氨酸（P)和苏氨酸（T)，据GOR算法测定，所述柔性 环具有多于95%的非结构性无规卷曲形成。
9. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，包含所述治疗性多肽、一个或多个pCloud