序列 和所述支架蛋白，其中所述pCloud序列可以置于所述治疗性多肽N端和C端中的任一端或 两端，且所述pCloud序列也可以置于所述支架蛋白N端和C端中的任一端或两端，其中所 述融合蛋白从N端至C端按照下述公式构造： (pCloud)m-TP- (pCloud)n-支架-(pCloud) (PCloud)m-支架-(pCloud)n-TP- (pCloud) k 其中： (a) pCloud为权利要求7或8所表征的pCloud多肽； (b) TP为治疗性多肽，其选自但不限于由以下构成的组：人胰高血糖素样 肽-I (GLP-I)、艾塞那肽（Exenatide)、GLP-2、C肽、降钙素、人甲状旁腺激素（PTH)、胰高血 糖素、G-CSF、GM-CSF、干扰素、白介素因子、VEFG受体、TNF a受体、RANK、生长激素、促红细 胞生成素、凝血因子、单链Fv、单域抗体及其功能性变体； (c) 支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体； (d) m为0或l;n为0或1，k为0或1，且m+n+k> = 1，所述数字表示所标明的多肽的 存在数量。
10. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述治疗性多肽系经由人源的蛋白连接 部分连接至所述pCloud序列，其中柔性环可用于融合所述治疗性多肽和所述蛋白连接部 分，所述柔性环在权利要求8中被表征，所述蛋白连接部分可以融合在所述治疗性多肽的N 端或C端，其中所述融合蛋白从N端至C端按照下述公式构造： (pCloud)m-TP-环- PCM - (pCloud)n -支架-(pCloud) (PCloud)m-支架-(pCloud)n-PCM -环- TP - (pCloud)k 其中： (a) pCloud为权利要求7或8中所表征的所述pCloud多肽； (b) TP为所述治疗性多肽，其选自但不限于由以下构成的组：人胰高血糖素样 肽-I (GLP-I)、艾塞那肽（Exenatide)、GLP-2、C肽、降钙素、人甲状旁腺激素（PTH)、胰高血 糖素、G-CSF、GM-CSF、干扰素、白介素因子、VEFG受体、TNF a受体、RANK、生长激素、促红细 胞生成素、凝血因子、单链Fv、单域抗体及其功能性变体； (c) 支架表示所述支架蛋白，其在溶液中形成同源三聚体； (d) m为0或l;n为0或1，k为0或1，且m+n+k> = 1，所述数字表示所标明的多肽的 存在数量； (e) 环为柔性环，其在权利要求8中被表征；以及 (f) PCM为所述人源的蛋白连接部分。
11. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述蛋白连接部分为人源的具有细长形 状的蛋白序列。
12. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述蛋白连接部分为人纤连蛋白III型 结构域。
13. 权利要求12所述的融合蛋白，其中所述人纤连蛋白III型结构域选自由以下构 成的组：肌腱蛋白（Tenascin)、Usherin、肌联蛋白、三分模体（TRIM)家族成员、组织因子、 TIEl、TIE2、SPEG、SORLl、SDKl、ROBOl、R0B02、SDK2、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶、催乳素受体、 110八1\1、^^]\11、^^]\12、肌间蛋白1(1117〇11168；[111)、肌间蛋白2(1117〇11168；[112)、肌球蛋白结合蛋 白C、LIFR、瘦素受体、整合素、胰岛素受体、接触蛋白（Contactin)、胶原蛋白、细胞因子受 体样因子、干扰素受体、生长激素受体、纤连蛋白、富亮氨酸跨膜蛋白（FLRT)成员、IL、肝配 蛋白（印hrin)A 型受体、肝配蛋白 B 型受体、IL-6R、gpl30、ILllRA、IL12RB、IL20RB、IL23R、 IL27RA 和 IL31RA。
14. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述支架蛋白选自由以下构成的组：人 胶原蛋白非胶原（NC)结构域，其在溶液中形成稳定的同源三聚体；Clq样分子结构，其在溶 液中形成同源三聚体；TNF样分子结构，其在溶液中形成同源三聚体；以及具有C型凝集素 样结构域（CTLD)的蛋白质，其在溶液中形成同源三聚体。
15. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述支架蛋白选自由以下构成的组： Multiplexin型人胶原蛋白内的NCl结构域、FACIT型胶原蛋白内的NC2结构域、人Clq A 链、Clq B 链，Clq C 链、cbln 家族成员、人 EMILIN-1、多聚素（multimerin)、ACRP30/脂联 素、adipolin、抵抗素、抵抗素样分子（RELM)激素家族成员、人TNFalpha、TNFbeta、TRAIL、 RANK配体、Fas配体、⑶30配体、⑶40配体、⑶27配体、0X40L、⑶137、甘露聚糖结合凝集 素（MBL)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)、肝胶原凝集素I (CL-Ll)、胎盘胶 原凝集素1((^-?1)、共凝集素、431^&胶原凝集素（(^-43)和461^ &胶原凝集素（(^-46)、 Langerin、四连蛋白（Tetranectin)及其功能性变体。
16. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述支架蛋白优选地选自Multiplexin 型人胶原蛋白内的NCl结构域，例如来自胶原蛋白XV和胶原蛋白XVIII的NCl结构域。
17. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述治疗性多肽选自但不限于由以下构 成的组：人胰高血糖素样肽-1(61^-1)、艾塞那肽伍狀11 &^(16)、61^-2、(：肽、降钙素、人甲状 旁腺激素（?加、胰高血糖素、643?、61?^、干扰素、白介素因子、￥￡6?受体、1即€ [受体、 RANK、生长激素、促红细胞生成素、凝血因子、单链Fv、单域抗体及其功能性变体。
18. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：治疗性多肽，其选自 GLP-I、GLP-I (A8G/G22E)、GLP-I (A8G/G22E/R36G)和 GLP-I (A8G/G22E/R36S)所组成的组； 柔性环；蛋白连接部分，其选自人纤连蛋白结构域7 (Fn7)、人纤连蛋白结构域8 (FnS)和人 肌腱蛋白C纤连蛋白III型结构域3(TNCfn3)所组成的组；pCloud多肽序列，其如权利要 求7或8所定义；以及支架蛋白，其选自人胶原蛋白XVIII NCl结构域（C0L18NC1)、人胶原 蛋白XV NCl结构域（C0L15NC1)、人胶原蛋白XIV NC2结构域（C0L19NC2)和ACRP30Clq样 结构域所组成的组。
19. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：GLP-1 (A8G/G2 2E/ R36S)或 GLP-I (A8G/G22E/R36G)、柔性环、Fn8、pCloud 多肽和 C0L18NC1。
20. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白选自SEQ ID NO: 1-31所组 成的组。
21. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，包含与选自SEQ ID NO: 1-31的任一序列具有 至少90%序列同一性的蛋白质序列。
22. 前述任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述柔性非结构性多肽和/或所述 pCloud序列的长度可以被改变，以调节所述融合蛋白的表观分子量（流体力学半径和/或 回转半径）和/或体内半衰期。
23. 前述任一权利要求所述的含有所述pCloud多肽的融合蛋白，其中当所述柔性非结 构性多肽和/或所述pCloud序列连接至所述治疗性多肽时，增强所述治疗性多肽的热稳定 性和溶解度。
24. 多核苷酸序列，其编码前述任一权利要求所述的融合蛋白。
25. 表达载体，其包含权利要求24所述的多核苷酸序列和表达控制元件。
26. 药物组合物，其包含前述权利要求1-23的任一项所述的融合蛋白和可药用载体。
27. 前述权利要求1-23的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白可以通过PEG化 (PEGylation)进一步修饰，以延长所述融合蛋白和PEG缀合物的所述体内半衰期，所述PEG 部分可具有介于2kDa和IOOkDa之间的分子量。
28. 改善治疗性多肽的药代动力学性质的方法，其包含步骤：将所述治疗性多肽融合 至一个或多个柔性非结构性多肽（和/或pCloud多肽）及三聚体支架蛋白，所述融合蛋白 可以进一步含有人源的蛋白连接部分，所述融合蛋白具有以下性质：(a)所述融合蛋白的 终末半衰期相较所述治疗性多肽自身的终末半衰期显著延长；(b)所述融合蛋白在生理条 件下的稳定性和溶解度相较所述治疗性多肽自身的稳定性和溶解度得到改善。
【专利摘要】本发明提供了融合蛋白，其包括融合至一个或多个柔性非结构性多肽和三聚体支架蛋白的治疗性多肽。所述融合蛋白内的所述柔性非结构性多肽序列表现为一个或多个源自人纤维蛋白原α链的pCloud序列，两侧可以为人源的蛋白连接部分。本发明还提供了包含所述融合蛋白的药物组合物、编码所述融合蛋白的核酸分子、含有所述核酸的载体、被所述载体转化的宿主细胞以及制造所述融合蛋白的方法及其应用。
【IPC分类】C07K19-00, C12N15-63, A61P35-00, C12N15-62, A61K38-00, A61P3-08
【公开号】CN104870478
【申请号】CN201380067873
【发明人】钱信果, 洪维, 马晓宇
【申请人】北京安信怀德生物技术有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2013年12月19日