列中，纤维蛋白原片段两侧为长度多样的柔性环。因此pCloud 主要是人源的，对人给药时具有低免疫原性。（c)所述pCloud序列富含甘氨酸（G)、丝氨酸 (S)和谷氨酸（E)。所述pCloud还含有丙氨酸（A)、脯氨酸（P)、精氨酸（R)和苏氨酸（T)。 G、S、E、A、P和T合计构成所述pCloud序列的超过90%。（d)据G0R算法测定，所述pCloud 序列具有大于90%的非结构性无规卷曲形成；以及（e)据TEPIT0PE算法预测，所述pCloud 序列不含任何T细胞表位。在所述pCloud多肽中，人纤维蛋白原片段两侧为0至100个残 基的长度可变的柔性环。
[0048] 本发明中术语"柔性环"是指具有0到100个残基的长度可变的蛋白质序列。这 些柔性环富含甘氨酸（G)和丝氨酸（S)。这些柔性环也可含谷氨酸（E)、丙氨酸（A)、脯氨酸 (P)和苏氨酸（T)。据G0R算法测定，这些柔性环具有多于95%的非结构性无规卷曲形成。 所述柔性环一般是具有更短长度和更高柔性的柔性非结构性多肽接头。本领域技术人员将 会理解，所述柔性环可在融合蛋白内用作间隔子（spacer)以提供柔性。
[0049] "片段"为天然蛋白质的截短形式。术语蛋白质的"变体"或"功能性变体"是指 所述天然蛋白质的修饰版本，其包含一个或几个氨基酸的替换、删除和/或添加，并且其基 本保留所述天然蛋白质的生物活性。例如，变体蛋白质可以与参比蛋白质具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，氨基酸 的保守性替换是优选的，所述替换为技术人员的公知常识。删除优选为从不参与所述蛋白 质生物功能的区域删除氨基酸。例如，GLP-1(A8G/G22E/R36G)为野生型GLP-1的功能性变 体，其含有三个氨基酸替换，并且如cAMP检测所示，其基本保留或增加其生物活性。
[0050] "缀合"、"连结"、"连接"和"融合"在本文可互换使用。这些术语是指将两个或更多 的化学元素或成分以任何方式结合在一起，包括化学缀合或重组方式。例如，两个不同的蛋 白质可以通过"框内融合"连结在一起，"框内融合"是指将两个或更多个开放阅读框（〇RFs) 按照保持原〇RFs的正确阅读框的方式结合，以形成更长的连续0RF。因此，所得的重组融合 蛋白为含有两个或更多个区段的单个蛋白，所述区段对应于原〇RFs所编码的多肽（自然界 正常情况下所述区段不会如此结合）。再举一例，这两个蛋白也可以通过使用化学交联剂连 结在一起，获得含有由交联剂连接的两个单独多肽的蛋白缀合物。
[0051] 在描述多肽的语境中，"序列"为多肽中从氨基段至羧基端方向的氨基酸顺序，其 中所述序列中彼此相邻的残基在所述多肽的一级结构中相连。
[0052] 术语"DNA"、"多核苷酸"、"核酸"、"核苷酸"（nucleotides)和"寡核苷酸"可互换 使用。它们是指任意长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸或是脱氧核糖核苷酸，或是核糖 核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任意三维结构，并可以表现出任何已知或未知的功 能。以下为多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定 义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核 苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引 物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果修饰存在， 可以在所述聚合体组装之前或之后对所述核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷 酸成分中断。多核苷酸在聚合后可以被进一步修饰，例如与标记成分缀合。
[0053] 术语蛋白质的"功能性变体"是指天然蛋白质的修饰版本，其包含一个或几个氨基 酸的替换、删除和/或添加，例如少于15个氨基酸，或优选地少于10个或5个氨基酸，并且 其基本保留所述天然蛋白的生物活性。通常，氨基酸的保守性替换是优选的，所述替换为技 术人员的公知常识。删除优选为从不参与所述蛋白质生物功能的区域内删除氨基酸。例如， GLP-1 (A8G/G22E)和GLP-1 (A8G/G22E/R36G)是野生型GLP-1的功能性变体，该变体含有两 个或三个氨基酸替换，并且基本保留其生物活性，例如提高cAMP水平。
[0054] 发明详细描沐
[0055] 本发明一方面提供了通过将治疗性多肽融合至一个或多个柔性非结构性多肽序 列及支架蛋白以增加该治疗性多肽半衰期的方法。所述支架蛋白可以在溶液中形成稳定的 同源三聚体。此方法可以有效地增加多肽分子的流体力学半径和/或回转半径（Rg)，以延 长其体内半衰期。此外，改变融合蛋白内的柔性非结构性多肽接头的长度可以以可调的方 式调节该融合蛋白的体内半衰期。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白可以进一步包含 人源的蛋白连接部分，优选为具有细长形状的蛋白质序列。该蛋白连接部分可以经由柔性 环连接至治疗性多肽。该蛋白连接部分可以经由长度可调的柔性非结构性接头连结到支架 蛋白。由本发明提供的这一新颖方法称为"三叉戟技术"，可以有效地改善治疗性多肽的药 代动力学性质。
[0056] 在本发明的优选实施方式中，柔性非结构性接头表现为一个或多个非结构性 pCloud多肽。融合蛋白内，治疗性多肽、pCloud多肽和支架蛋白可以按多种方式排列。例 如在一些实施方式中，治疗性多肽直接连接至pCloud多肽和支架蛋白（图la)。在一些实 施方式中，治疗性多肽经由人源的蛋白连接部分与pCloud多肽及支架蛋白融合，所述蛋白 连接部分优选为具有细长形状的蛋白质序列（图lb)。在一些实施方式中，治疗性多肽和 pCloud多肽可以融合在支架蛋白的相对的两端（图lc)。
[0057] 在本发明的优选实施方式中，本发明的方法可以拥有优于传统的PEG化方法或 Fc/HAS融合方法的数项主要优点。1.本发明的方法中，对多肽分子的PEG化不是必需的， 因此完全保留了该治疗性多肽的生物活性。2.因为支架蛋白形成同源三聚体，所以治疗性 多肽与该支架蛋白的融合蛋白可以大大增加该融合蛋白的表观大小，以减缓肾滤过。此外， 三聚体的形成也使该融合蛋白呈三价。这可以大大增加该治疗性蛋白的活性。3.融合蛋白 内柔性非结构性多肽接头的长度对于决定该融合蛋白的体内半衰期发挥重要作用。本发明 的方法通过改变融合蛋白内柔性非结构性多肽接头的长度，为微调治疗性多肽的体内半衰 期提供了平台。4.支架蛋白和pCloud多肽优选由人蛋白产生，通常来自人胞外蛋白，因此 没有外源蛋白序列被引入至融合蛋白。使用本方法生成的融合蛋白免疫原性低。5.在许多 情况下，本发明的重组融合蛋白可以使用大肠杆菌（E.coli)表达系统生成，这消除了对一 些治疗性多肽的昂贵化学合成工艺的需求，或是使用真核表达系统的需求。
[0058] 柔性非结构性多肽序列
[0059] 在本发明中，融合蛋白内柔性非结构性多肽序列对于延长治疗性多肽的半衰期起 到关键作用。柔性非结构性多肽序列的长度对决定融合蛋白的流体力学半径和/或回转半 径起到重要作用。柔性非结构性多肽的一级序列严重影响着融合蛋白的稳定性和溶解度。
[0060] 术语"柔性非结构性多肽"是指在运动中呈柔性并且不形成任何常规稳定的二级 和三级蛋白结构的氨基酸序列。所述柔性非结构性多肽序列含有1至3000个氨基酸残基， 其中G、S、E、A、P和T合计构成所述柔性非结构性多肽序列的超过90% ;且据G0R算法测 定，所述柔性非结构性多肽序列具有大于90%的非结构性无规卷曲形成[10]。
[0061] 如果该治疗性多肽是相对较大的蛋白质（例如干扰素、生长激素、促红细胞生成 素、G-CSF或TNFR2,通常为具有超过100个氨基酸残基的蛋白质），它可以通过柔性非结 构化多肽接头直接融合至支架蛋白。在另一些情况下，该治疗性多肽可能是短肽（例如 GLP-1、艾塞那肽、GLP-2、C肽、降钙素或PTH，通常为不超过100个残基的肽）。为了有效利 用我们的方法，该融合蛋白可以进一步含有人源的蛋白连接部分，优选为具有细长形状的 蛋白质序列，例如人纤连蛋白III型结构域。治疗性多肽和柔性非结构性多肽接头通过使 用蛋白连接部分连接。该蛋白连接部分可以进一步增加该融合蛋白的流体力学半径和/或 回转半径（Rg)。此外，该蛋白连接部分可以稳定治疗性多肽。在一些实施方式中，蛋白连接 部分可以包含整个蛋白质、蛋白质的截短版本、蛋白质结构域或串联的多个结构域、或是蛋 白质片段。本领域技术人员将会理解，蛋白连接部分可以包含一些并非由氨基酸形成的非 蛋白修饰，例如PEG。
[0062] 柔性非结构性接头的长度可以对决定融合蛋白的流体力学半径和/或回转半 径（Rg)及体内半衰期起有重要作用。柔性非结构性多肽接头可以含有序列例如（G5S)n、 (G4S)n、（G3S)n、（GS)n、（G2S2)n、（G3S3)n、（GS3)n，其中 n 为整数，或是其他富含 G、S、A、T 或P的序列。柔性接头的长度可以为1至3000个氨基酸残基不等，特别是在5至500个氨 基酸残基的范围内。现已报道，多肽的非结构性伸展可以与PEG分子表现类似，并增加该蛋 白质分子的流体力学半径和/或Rg[13]。由于三聚体的形成，与单体相比，通过使用我们的 方法达到所期望的Rg需要相对更短的柔性接头。通过降低免疫原性，这对治疗性蛋白质而 言可具有巨大优势。
[0063] 在本发明的一些实施方式中，融合蛋白可以含有一个或多个柔性非结构性多肽接 头。本领域技术人员将会理解，该融合蛋白内的这些柔性非结构性接头可以相同或不同。 [0064] 我们的数据清楚表明，改变单个或多个柔性非结构性接