反应体系为：1 μ L DNA，上下游引物 TsFl 和 TsR2 各 0· 2 μ M，10 μ L Taq Mix 和余量ddH20,共20 yL。
[0036] PCR反应条件为：预变性95°C 2min;95°C 15s，退火温度56°C~66°C 15s和 72°C 15s，共 30 循环。
[0037] (2)将10 yL PCR产物用1%琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示，表明该组特异引 物都能扩增出柑橘半穿刺线虫ITS DNA，条带大小与预测相符合。
[0038] 然后使用软件AlphaEaseFC读取条带亮度，确定扩增效率最高的退火温度，结果 如附图2所示，在退火温度为60度时，该组引物的扩增效率最高。
[0039] 实施例2实时荧光PCR的反应体系的特异性 1、根据实施例所设计的引物和探针，建立了一种检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光PCR 方法： PCR反应体系为：IyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0.2 μΜ，探针Tsprol 0.10 μ Μ，10 μ L实时荧光定量PCR预混试剂和余量ddH20,共20 μ L。
[0040] PCR反应条件为：预变性95°C 2min ;95°C 15s，退火温度60°C 15s和72°C 15s，共 30循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包括实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚合 酶，缓冲液和dNTP。
[0041] 2、特异性检测 为验证本发明引物和探针，以及实时荧光PCR方法的有效性和特异性，本实施例分别 以多个不同种群的柑橘半穿刺线虫和其他非靶标线虫的DNA为模板，进行检测，所用线虫 的具体种类如表1所示。
[0042] 表1实验中使用的线虫种群及对应的Ct值
结果如表1所示，本发明所述的实时荧光PCR方法能有效的检测不同种群的靶标线虫 (柑橘半穿刺线虫)。并且对非靶标不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。 [0043]同时，本发明所述的体系能有效的检测到单条的靶标线虫，满足实际的检测和定 旦电商 里插女O
[0044] 实施例3实时荧光定量PCR反应体系的灵敏性及定量柑橘半穿刺线虫的标准曲 线 在体视镜下挑取100条的柑橘半穿刺线虫，按照上述方法提取DNA，然后对该DNA样品 进行梯度稀释(如表2所示)。
[0045] 表2制作标准曲线使用的DNA样品浓度和对应的Ct值
2、以上述各稀释浓度的DNA样品进行实时荧光PCR扩增，PCR反应体系和条件与实施 例2相同。
[0046] 结果如附图3所示，在扩增0. 1~100条靶标线虫时都呈现良好的线性关系，说明该 体系能准确的定量样品中线虫的数量。
[0047]另外，结果也说明了本发明所述的体系的检测柑橘半穿刺线虫的灵敏性能够达到 到〇. 1条的灵敏度。
[0048] 实施例4混合线虫样品检测 因为从田间分离的土样中经常含有多种不同的线虫，因此，我们还测试了在混合线虫 的样本中能不能准确的检测和定量靶标线虫。
[0049] 1、我们做了三个实验组： (1) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条秀丽小杆线虫(一种在土壤中常见的腐生 线虫）的土样中； (2) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到含有100条咖啡短体线虫的土样中； (3) 把1条柑橘半穿刺线虫加入到不含其他线虫的土样中。
[0050] 同时我们还使用了只含有100条秀丽小杆线虫和只含有100条咖啡短体线虫的样 品作为对照。
[0051] 2、对分别对上述三个实验组进行实时荧光PCR扩增，测试本发明体系的扩增效率 是否会受到非靶标线虫的影响。
[0052] 结果显示，在含有100条秀丽小杆线虫或咖啡短体线虫的样本中，本发明所述的 方法仍然能准确的检测并定量1条的柑橘半穿刺线虫（附图4所示)，这说明本发明所述的 实时荧光PCR方法能准确地同时检测和定量样品中靶标线虫(柑橘半穿刺线虫）的数量，而 且不受其他非靶标线虫的影响。
[0053] 实施例5田间土壤样品的检测 1、从田间土壤样品中检测并定量柑橘半穿刺线虫的数量，分别从阳江6个不同的柑橘 园，以及佛闪、阳山和湖南的柑橘园采集到柑橘根围土壤样品9份。
[0054] (1)把获得的9份土样，取100克经过贝曼漏斗法分离和显微镜鉴定，确定有两份 土样中含有柑橘半穿刺线虫(见表3,显微镜法确定结果是4号和5号样品含有柑橘半穿刺 线虫)。
[0055] (2)另外把上述9份土样，各取1克使用PowerSoil? DNA提取试剂盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)提取 DNA，然后使用 PowerClean ? DNA 纯化试剂盒（PowerClean? DNA Clean-up Kit，购自 MO BIO Laboratories，Inc.)纯化 上述获得的DNA，最后定容至20 μ L，再使用本发明上述实时荧光PCR方法进行鉴定和定量 检测。
[0056] 2、结果如表3所示 表3
结果显示，显微镜法显示阳性的样品，本发明的实时荧光定量PCR方法能更快速的检 测出来，并进行定量。
[0057] 同时，对于1、2、3、6、7号样品柑橘半穿刺线虫的数量太少或已经死亡，显微镜法 没有办法鉴定出来。这不仅说明了本发明的实时荧光定量PCR方法的灵敏度高，而且能够 避免因采集的样品中线虫的存活情况对检测结果的影响，对于实际工作中柑橘半穿刺线虫 的早期检测和预防具有重要的意义。
【主权项】
1. 一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述 引物包括上游引物TsFl和下游引物TsR2,上游引物TsFl的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游 引物TsR2的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针为Tsprol，探针Tsprol的序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 根据权利要求1所述实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述探针Tsprol 的5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团ECL。3. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在检测 和/或定量检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。4. 权利要求1所述定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针在制备 检测和/或定量检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用。5. -种定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应所 用的引物和探针为权利要求1所述引物和探针。6. 根据权利要求5所述实时荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR反应体系为：lyL DNA，上下游引物TsFl和TsR2各0. 2yM，探针Tsprol0. 10yM，10yL实时荧光定量 PCR预混试剂和余量CldH2O，共20yL; PCR反应条件为：预变性95°C2min;95°C15s，退火温度60°C15s和72°C15s，共30 循环； 其中，所述实时荧光定量PCR预混试剂包含有实时荧光定量PCR反应所需要的DNA聚 合酶，缓冲液和dNTP。7. -种柑橘半穿刺线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所 述引物和探针。8. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量 PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP。9. 根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光PCR检测试 剂盒，该试剂盒的反应体系和反应程序同权利要求6所述。10. 权利要求5所述实时荧光PCR方法或权利要求7所述检测试剂盒在定量检测柑橘 半穿刺线虫方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一组定量检测柑橘半穿刺线虫的实时荧光定量PCR引物和探针及其应用。所述引物包括上游引物TsF1和下游引物TsR2，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述探针为Tspro1，探针Tspro1的序列如SEQ ID NO.3所示。利用上述引物和探针建立的实时荧光定量PCR方法不仅能够特异的从混合线虫样品或基质中检测并定量柑橘半穿刺线虫，而且检测灵敏性可达到单条线虫的灵敏度，对实际应用工作，如检验检疫工作，有着重要的推广应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894248
【申请号】CN201510269940
【发明人】卓侃, 廖金铃, 林柏荣, 王宏洪
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日