一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及枯草芽孢杆菌，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺。
【背景技术】
[0002]我国是世界上从事水产养殖大国，养殖业占农业生产的重要比重。随着养殖业集约化程度不断提高，养殖水体的理化环境和生态环境日亦恶化；同时，生活污水和工业废水的排放也加剧了养殖水体质量的下降；这些问题造成养殖病害日趋严重，养殖户损失巨大。
[0003]微生物环境修复法是今年来发展的一种绿色环境治理方法，具有修复时间短，操作简便，费用低，环境友好等特点。枯草芽孢杆菌是一种利用微生物修复水体环境的常用益生菌，枯草芽孢杆菌在繁殖过程中可以分泌大量的胞外蛋白酶和脂肪酶，能迅速降环境中的有机组分，同时可以降低养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮、等含量明显降低，防止水体氮磷比失调，抑制蓝藻的过渡生长。因此，枯草芽孢杆菌是一种具有前景的水体修复剂。目前对于枯草芽孢杆菌的工业化生产工艺，普遍存在着菌体生长速率慢，发酵水平偏低等缺陷，从而制约了微生物水体修复剂的推广。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，本发明的方法一般实验条件就容易做到，操作简单，生产周围短，产量高，具有广阔的用途。
[0005]本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，该方法包括如下步骤:
[0006](I)、将枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis (其中所述枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis菌株已在中国典型培养物菌种保藏管理中心保藏，地址中国湖北省武汉市武汉大学，保藏号HZW1CCTCC M 2014479，保藏时间2014年10月15日)接种与含I?1mL LB培养基(Luria-Bertani培养基)的无菌培养试管中，在25_37°C，150_400rpm的条件下摇床培养活化10_30h，LB培养基初始pH为6.5-7.5，作为一级发酵种子液；
[0007](2)、将一级发酵种子液接种到改进培养基中，在培养温度为25?37°C，150—400rpm的条件下继续活化摇床培养5?24小时后作为二级发酵种子液，接种量:体积比2-10%，改进培养基初始pH为6.5-8.0，改进培养基成分和浓度以IL计算为:葡萄糖5 ?10g、酵母提取物 5 ?10g、蛋白胨 15g ?30g、KH2PO40.5 ?2g、K2HPO4.3H20 I ?5g、(NH4) 2S042 ?3g ；
[0008](3)、将活化的二级种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐培养，接种量:体积百分比为2 —15%，温度25-37 °C，溶解氧控制在10%?90%，pH控制在6.5?7.5，培养时间30?96小时，培养过程中向发酵罐内加入补料培养基，发酵结束后收集罐内发酵液；
[0009](4)、将发酵液在4000?8000rpm离心收集菌体，在30?50°C条件下烘干30?96小时。
[0010]作为优选，所述的发酵培养基为含有以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖45 ?60g.蛋白胨 15 ?30g.酵母粉 7 ?10g、MgSO4.7H201.2 ?8g、KH2PO40.5 ?2g、K2HPO4.3H201 ?5g、(NH4)2S042 ?3g、NaCl 0.I ?0.3g、CaCl20.3 ?0.6g，pH 6.0 ?8.0。
[0011]作为优选，在步骤(3)中，当发酵培养后期溶氧回升后至30%?50%，启动溶氧反向关联补料，即溶氧高于设置值，进行流加补料，补料后菌体代谢旺盛则溶氧下降，待补入养分耗尽溶氧上升，再次激发补料，重复循环直至菌体生长密度达到极限为止；所述的补料培养基为以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖100?500g，蛋白胨30?60g，酵母粉10?20go
[0012]本发明的有益效果为:采用葡萄糖为主要碳源的培养基组分，后期通过溶氧联动进行持续补料发酵可以大大提高菌体生长速率。在优化条件下经过72小时发酵菌体产量可达湿重220g/L以上，菌体经发酵低温干燥以后产量可达30g/L。该法制备的枯草芽孢杆菌菌体干粉，成本低廉，发酵工艺简单，生产周期短，具有广阔的生产应用前景。
【具体实施方式】
[0013]下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
[0014]本发明所述的这种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，该方法包括如下步骤:
[0015](1)、将枯草芽孢杆菌(其中所述枯草芽孢杆菌菌株已在中国典型培养物菌种保藏管理中心保藏，保藏号HZW1CCTCC M 2014479)接种与含I?1mL LB培养基(Luria-Bertani培养基)的无菌培养试管中，在25-37°C，150-400rpm的条件下摇床培养活化10-30h，LB培养基初始pH为6.5-7.5，作为一级发酵种子液；
[0016](2)、将一级发酵种子液接种到改进培养基中，在培养温度为25?37°C，150—400rpm的条件下继续活化摇床培养5?24小时后作为二级发酵种子液，接种量:体积比2-10%，改进培养基初始pH为6.5-8.0，改进培养基成分和浓度以IL计算为:葡萄糖5 ?10g、酵母提取物 5 ?10g、蛋白胨 15g ?30g、KH2PO40.5 ?2g、K2HPO4.3H20 I ?5g、(NH4) 2S042 ?3g ；
[0017](3)、将活化的二级种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐培养，接种量:体积百分比为2 —15%，温度25-37 °C，溶解氧控制在10%?90%，pH控制在6.5?7.5，培养时间30?96小时，培养过程中向发酵罐内加入补料培养基，发酵结束后收集罐内发酵液；当发酵培养后期溶氧回升后至30%?50%，启动溶氧反向关联补料，即溶氧高于设置值，进行流加补料，补料后菌体代谢旺盛则溶氧下降，待补入养分耗尽溶氧上升，再次激发补料，重复循环直至菌体生长密度达到极限为止；所述的补料培养基为以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖100?500g，蛋白胨30?60g，酵母粉10?20g。
[0018](4)、将发酵液在4000?8000rpm离心收集菌体，在30?50°C条件下烘干30?96小时。
[0019]所述的发酵培养基为含有以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖45?60g.蛋白胨 15 ?30g.酵母粉 7 ?10g、MgSO4.7Η201.2 ?8g、KH2PO40.5 ?2g、K2HPO4.3H201 ?5g、(NH4) 2S042 ?3g、NaCl 0.I ?0.3g、CaCl20.3 ?0.6g，pH 6.0 ?8.0。
[0020]实施例1:
[0021](I)、将25ul冷冻保存的枯草芽孢杆菌的菌种接种在3ml的LB培养基(pH6.5)中，在37°C下摇床培养(200rpm)活化20h ;将3ml活化的一级种子接种到50ml的改进培养基中继续活化12h作为二级发酵种子。改进培养基成分和浓度为(IL):葡萄糖5g、酵母提取物 5g、蛋白胨 15g、KH2PO4L 5g、K2HPO4.3H20 lg、(NH4)2S042g pH 6.5。培养条件:摇床培养(250rpm)，温度为 37 °C。
[0022](2)、将50ml活化的二级种子接种到含3L培养基的5L发酵罐培养基中进行培养，温度37°C，溶解氧控制在30%关联转速(300?800rpm)，pH控制在6.5，每隔12小时取样测定菌体湿重，培养时间为48小时。发酵培养基的组成:以IL水溶液计:葡萄糖50g.蛋白胨 20g.酵母粉 10g、MgSO4.7H204g、KH2PO4L 5g、K2HPO4.3Η201.5g、(NH4) 2S043g、NaCl 0.3g ；
[0023]用该种方法得到的菌体湿重最高为98g/L，烘干后菌体产量可达13g/L。。
[0024]实施例2:
[0025](I)、将50ul冷冻保存菌种接种在20mLpH7的LB培养基中，在37°C下摇床培养(200rpm)活化24h。将1ml活化的一级种子接种到300ml改进培养基中继续活化15h。培养条件:摇床培养(250rpm)，温度为37°C。改进培养基成分和浓度(IL)为:葡萄糖5g、酵母提取物 5g、蛋白胨 15g、KH2PO4L 5g、K2HPO4.3H20 lg、(NH4)2S042g pH 6.5。
[0026](2)、将300ml活化的二级种子接种到含1L发酵培养基的15L发酵罐上培养，培养条件:37°C，控制溶解氧在20%，每隔12小时取样测定菌体浓度，待溶氧值从0%重新回升至30%时启动溶氧反向关联补料，即溶氧尚于30%，启动进彳丁流加补料，补料后菌体代谢旺盛则溶氧下降，待补入养分耗尽溶氧上升，再次激发补料，重复循环直至菌体生长密度达到极限为止，发酵时间72小时；发酵培养基的组成，以IL水溶液计:葡萄糖60g、蛋白胨30g、酵母粉 10g、MgSO4.7H204g、KH2P042g、K2HPO4.3H201、(NH4) 2S043g、NaCl0.3g ;补料培养基为以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖500g，蛋白胨60g，酵母粉20g。
[0027](3)、发酵结束后将发酵液在SOOOrpm离心，收集菌体，铺平置于烘箱，在45°C条件下烘干72小时。
[0028]用该种方法得到的菌体湿重最高为220g/L，烘干后菌体产量可达30g/L。
[0029]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1.一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，其特征在于:该方法包括如下步骤: (1)、将枯草芽孢杆菌接种与含I?1mLLB培养基的无菌培养试管中，在25-37°C，150-400rpm的条件下摇床培养活化10_30h，LB培养基初始pH为6.5-7.5，作为一级发酵种子液； (2)、将一级发酵种子液接种到改进培养基中，在培养温度为25?37°C，150—400rpm的条件下继续活化摇床培养5?24小时后作为二级发酵种子液，接种量:体积比2-10%，改进培养基初始PH为6.5-8.0，改进培养基成分和浓度以IL计算为:葡萄糖5?10g、酵母提取物 5 ?10g、蛋白胨 15g ?30g,KH2PO4 0.5 ?2g,K2HPO4.3H201 ?5g、(NH4)2SO4 2 ?3g ； (3)、将活化的二级种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐培养，接种量:体积百分比为2 —15%，温度25-37°C，溶解氧控制在10%?90%，pH控制在6.5?7.5，培养时间30?96小时，培养过程中向发酵罐内加入补料培养基，发酵结束后收集罐内发酵液； (4)、将发酵液在4000?8000rpm离心收集菌体，在30?50°C条件下烘干30?96小时。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，其特征在于:所述的发酵培养基为含有以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖45?60g.蛋白胨15?30g.酵母粉7?10g、MgSO4.7H20 1.2 ?8g、KH2PO4 0.5 ?2g、K2HPO4.3H20 I ?5g、(NH4)2SO4 2 ?3g、NaCl0.1 ?0.3g、CaCl2 0.3 ?0.6g，pH 6.0 ?8.0。3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，其特征在于:在步骤(3)中，当发酵培养后期溶氧回升后至30%?50%，启动溶氧反向关联补料，即溶氧高于设置值，进行流加补料，补料后菌体代谢旺盛则溶氧下降，待补入养分耗尽溶氧上升，再次激发补料，重复循环直至菌体生长密度达到极限为止；所述的补料培养基为以下组成的水溶液，以IL计:葡萄糖100?500g，蛋白胨30?60g，酵母粉10?20g。
【专利摘要】本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的发酵生产工艺，包括如下步骤：1、将枯草芽孢杆菌接种与无菌培养试管中，摇床培养活化，作为一级发酵种子液；2、将一级发酵种子液接种到改进培养基中，继续活化摇床培养后作为二级发酵种子液；3、将活化的二级种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵罐培养；4、将发酵液在4000～8000rpm离心收集菌体，在30～50℃条件下烘干。本发明的有益效果为：采用葡萄糖为主要碳源的培养基组分，后期通过溶氧联动进行持续补料发酵可以大大提高菌体生长速率。该法制备的枯草芽孢杆菌菌体干粉，成本低廉，发酵工艺简单，生产周期短，具有广阔的生产应用前景。CCTCC M 201447920140617
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/125
【公开号】CN104911120
【申请号】CN201510105687
【发明人】陈玮, 陈海敏, 梁宗锁, 盛清, 杨建林, 王海荣, 胡秀芳, 刘立丽
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年3月11日