保护.2012. 38(4) :141-143);
[0082] 草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea Persoon)(朱宝成等.草莓灰霉病菌的培养、 毒素提取及生物测定.植物病理学报.1994,24(3) :239-243);
[0083] 甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl. f. sp. conglutinans(Wollenw. )Snyder&Hansen](李明远等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴 定·植物保护.2003, 29 (3) :44-45);
[0084] 西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum)(耿丽华等.西瓜枯萎病菌生 理小种鉴定技术体系的建立和验证.中国蔬菜.2010 (20) :52-56);
[0085] 棉花枯萎病菌-尖孢镰刀菌萎蔫专化型|^11831'；[11111€^8。0；10111130111.；^8口· vasinfectum(Atk)Snyder&Hansen](李明桃·棉花枯萎病的研宄.农业灾害研 宄· 2012, 2(04) : 1-3, 16);
[0086] 豌豆镰孢根腐病菌-前镰孢豌豆专化型（Fusarium solani f. sp. pisi)(向 妮等.豌豆镰孢根腐病菌的鉴定及其致病基因多样性.中国农业科学.2012,45(14): 2838-2847)；
[0087] 百合根腐病菌-尖孢镰孢病菌（Fusarium oxysporum Schlecht.)(安智慧等·百 合根腐病病原鉴定及防治方法.中国蔬菜.2010(3) :23-24);
[0088] 小麦赤霉病菌-禾谷镜刀菌（Fusarium graminearum Schwabe) (Rubella S. Goswami&H. Corby Kistler. Heading for disaster:Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology. 2004, 5 (6):515-525)；
[0089] 小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis)(纪兆林等.小麦纹枯病菌毒素对小麦植 株的作用.扬州大学学报（农业与生命科学版）.2011, 32 (3) :55-59);
[0090] 小麦全蚀病菌[Gaeumannomyces graminis (Sacc. )ArX&01ivier var. tritici J. Walker](刘卫国.药剂处理对小麦全蚀病防效及其产量因素的影响.湖北农业科 学.2012, 51 (16) :3483-3484,3487);
[0091] 桃褐腐病菌-链核盘菌[Monilinia fructicola(wint.)Rehm](王菲等.桃褐腐 病的发生与防治·果树花丼.2012,05 :58-59);
[0092] 葡萄炭疽病菌-胶抱炭疽菌（Colletortrichum gloeosporioides Penz. e t Sacc.)(李利霞等.葡萄炭疽病菌S R AP遗传多样性分析.中国农学通报.2012, 28(12): 230-235)；
[0093] 苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea (Moug. ) Ces. et de Not.)(张宏霞 等.苹果轮纹病的发生规律及防治技术初探.安徽农学通报.2011，17(20) :78-79);
[0094] 平葫褐斑病菌--托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii Paine)(金丹 等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定.食用菌学报.200916(1) :89-91);
[0095] 黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans) (A. T. Alleyne，K. Rowe， M. James. Identification of Pseudomonas syringae pv. lachrymans in Barbados by rep-PCR. Journal of Agricultural Science and Technology BI.2011 :593-597)；
[0096] 前子青枯病菌（Ralstonia solanacearum)(封林林等.前子青枯病抗性材料的鉴 定及性状观察·长江蔬菜.2000,10 :35-37);
[0097] 大白菜黑腐病菌-野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris(Pam. )Dowson](翟文慧等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株 期抗病性的相关分析.中国蔬菜.2010 (10) :59-63)。
[0098] 下述实施例中相关培养基的配置：
[0099] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL。
[0100] LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至 1000 mL, pH 7. 0-7. 2〇
[0101] LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，用蒸馏水定容 至 1000mL，pH 7. 0-7. 2。
[0102] KB 固体培养基：蛋白胨 20g，MgSO4 · 7H20 L 5g，K2HPO4L 5g，甘油 10mL，琼脂 20g， 用蒸馏水定容至1000mL，pH 6· 8,121°C灭菌30min。
[0103] CM0002培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，MnSO4 · H2O 5mg，蒸馏 水 lOOOmL，调 pH 至 7. 0,121°C湿热灭菌 20min。
[0104] CM培养液的配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，用蒸馏水定容至lOOOmL， ρΗ7· 4,121°C 湿热灭菌 20min。
[0105] 种子培养基/发酵培养基：葡萄糖l〇g，蛋白胨l〇g，NaCl 5g，牛肉膏3g， MnSO4 · H205mg，用蒸馏水定容至 1000mL，pH 7· 2-7. 4。
[0106] 实施例 1、深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No. 10919 的分 1?及鉴定
[0107] 一、深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No. 10919 的分离
[0108] 对采自内蒙古的50份土壤样品进行如下操作：取土壤样品lg，再加入9mL无菌 水，振荡15min，使其充分溶解，混匀后在沸水浴中高温水浴处理10min，期间振荡2-3次。震 荡结束后吸取ImL原液加入装有9mL无菌水的试管中，得到10 _ 1倍的稀释液，然后进行逐 级稀释，分别得到稀释倍数为KT 2-1〇_ 6的稀释液；分别吸取100 μ L不同稀释倍数的稀释 液至CM0002培养基平板上，用涂布棒涂匀，做好标记，每个梯度重复3次；再将涂好的平板 倒置放于37°C恒温箱中过夜培养。培养结束后挑选菌落特征不同的单菌落，划线纯化培养 在CM0002培养基平板上，并编号，倒置放于37°C恒温箱中过夜培养，再保存（刘国红，芽孢 杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研宄，福建农林大学，2009)。
[0109] 结果表明，从采自内蒙古的50份土壤样品中共分离得到207株细菌，经对甘蓝 枯萎病菌、西瓜枯萎病菌及番茄灰霉病菌等植物病原真菌的生物活性初筛和复筛，从中 得到一株抑菌活性高的菌株，编号为JZB120050,即为本申请的深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus) JZB120050CGMCC No. 10919(简称为 JZB120050 菌株）。
[0110] 二、深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No. 10919 的鉴定
[0111] 1、形态学鉴定
[0112] 深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No. 10919 的形态学特征 如下：菌体短杆状，直或近直，菌体单个或成对排列；有芽孢，椭圆形，在菌体中部、偏端或 顶端；在液体培养基中生长良好，为好氧菌；在LB固体培养基上生长迅速，培养三天后培养 基逐渐变黑；菌落表面干燥不透明，边缘不整齐（图1)。
[0113] 2、生理生化测定
[0114] 生理生化测定结果显示：深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050 CGMCC No. 10919是革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验、接触酶试验、吲哚试验、明胶液化试验、柠檬 酸盐利用试验和淀粉水解试验均为阳性结果，苯丙氨酸脱氨酶试验、硫化氢产生试验、氧化 酶试验、硝酸盐还原试验、V-P试验和M-R试验均为阴性结果。
[0115] 3、碳源利用鉴定
[0116] 采用美国Biolog微生物自动分析系统，以水为空白孔对照，对95种不同碳源进行 了分析，结果表明，深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus)JZB120050CGMCC No. 10919 能够 利用如下碳源：糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖、N-乙酰基-D-葡萄糖、熊果 苷、D-纤维二糖、D-果糖、a -D-匍萄糖、D-甘露糖、3-甲基-D-乳糖、α -甲基-D-匍萄糖 苷、β -甲基-D-葡萄糖苷、6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-洛酮糖、D-核糖、水杨 苷、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、L-苹果酸、丙酮酸甲酯、丙酮酸、L-天冬酰胺酸、2, 3- 丁二醇、 丙三醇、腺苷、肌苷、胸苷、尿苷、5' -单磷酸胸苷和D-L- α -磷酸甘油等碳源。
[0117] 不能够利用如下碳源：α -环糊精、淀粉、菊糖、甘露聚糖、L-树胶醛糖、D-阿拉伯 糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、m-肌醇、a -D-乳糖、乳果糖、D-松 二糖、D-蜜二糖、α -甲基-D-半乳糖、β -甲基-D-半乳糖、α -甲基-D-甘露糖、D-棉轩 糖、L-鼠李糖、景天庚酮聚糖、D-山梨醇、水苏糖、木糖醇、醋酸、α -羟基丁酸、P-羟基苯乙 酸、α -酮戊酸、乳酰胺、D-乳酸甲酯、L-乳酸、D-苹果酸、琥珀酸甲酯、丙酸、琥珀酰胺酸、琥 珀酸、酰基-L-乳酰胺谷氨、L-丙氨酸氨、D-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、 L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、丁二胺、5' -单磷酸腺苷、5' -单磷酸尿苷、6-磷酸-D-果糖、1-磷 酸-a -D-葡萄糖、6-磷酸-D-葡萄糖等碳源。
[0118] 可疑利用如下碳源：?_环糊精、苦杏仁苷、龙胆二糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露 醇、D-塔格糖、松二糖、γ -羟基丁酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸等碳源。
[0119] 4、分子鉴定
[0120] 采用常规方法提取深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus) JZBl20050CGMCC No. 10919的基因组DNA进行16S rDNA序列的PCR扩增及分析，选择通用引物 27F(5' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R(5' -ACGGATACCTTGTTACGACTT-3'），以提取 的基因组DNA作为模板，PCR扩增条件为94°C预变性5min ;94°C变性40s，55°C退火40s， 72°C延伸90s，30个循环；72°C补充延伸10min，4°C保存。
[0121] 采用常规方法提取深褐芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus) JZB120050CGMCC No. 10919的基因组DNA进行16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增及分析（刘国红，芽孢 杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研宄，福建农林大学，2009)，采用引物ITS-F ( 5' -TCGCTAGTAATCGCGGATCAGC-3'）和 ITS-R(5' -GCATATCGGTGTTAGTCCCGTCC-3'），以提取的 基因组DNA作为模板，PCR扩增条件为95°C预变性45s ;94°C变性15s，58°C退火30s，72°C 延伸90s，30个循环；72°C补充延伸10min，4°C保存。
[0122] 16S rDNA序列的PCR扩增和16S-23S rDNA之间的ITS序列PCR扩增的体系均为 25 μ L 扩增体系，包含：IOpmoL 引物各 1 μ L，超纯 dNTP Mixture 1 μ L，2. 5U Taq DNA 聚合 酶（TaKaRa) 0.5 μ L，10 XPCR Buffer (TaKaRa) 2.5 μ L，基因组 DNA 模板 lyL，ddH20 18 μ L。
[0123] PCR扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，检测到目标条带后，PCR产物直接 送至公司测序，利用DNAMN version 5. 2. 2和GenBank上的BLAST比对及分析序列，利用 CLUSTALX 1.83和Mega 5. 0软件构建系统发育树。
[0124] 结果表明，16S ri)NA序列的PCR扩增得到1451bp的片段（图2)，其序列如SEQ ID No. 1 所;^，与 Bacillus atrophaeus strain NMB28(Genbank 登录号 KF056326)的同源性 是100%，16S-23S ri)NA之间的ITS序列的PCR扩增得到628bp的片段（图2)，其序列如 SEQ ID No. 2 所;^，与 Bacillus atrophaeus strain NMB28 (Genbank 登录号是 KF05632