，所以试剂盒中也可以参见上述引物部分的描述，添加上 述竞争性引物P3、引物P4和引物P5 ;便于技术人员在检测中进一步进行半定量的竞争性 RT-PCR的实施。
[0026] 进一步使用上述半定量检测试剂盒进行IFN-y的mRNA表达水平检测过程中，其 目的是针对mRNA，基于RNA自身非常不稳定且在体外非常容易被降解的情形，所以在试剂 盒中可以添加RNase的抑制剂，比如DEPC(Diethy pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）；在进行 检测的过程中向提取的mRNA中添加，以避免靶RNA被降解而影响检测的准确性。
[0027] 进一步在本发明上述试剂盒实施的过程中，由于检测的过程中其获取的原始的材 料和检测的对象一般是外周血单个核细胞，如果出现是相对某些癌症患者的中后期阶段， 那么单个核细胞中自然含有较高水平的IFN- y的mRNA，可以被比较容易的检测出来，而如 果是这些疾病病变的非常潜伏期或者是发病的早期，IFN-y的mRNA在单个核细胞中的表 达情况非常微量，可能达不到检测的标准。所以可以进行放大，使其表达能够达到被检测的 程度；具体获取的待测的原始材料为单个核细胞，那么放大的方式可以采用PMA(佛波酯） 和/或calcium ionophore (妈离子载体，购自上海浩然生物）对单个核细胞进行诱导，使 其在原始代谢的基础上提升其表达倍数，而且有试验表明，PMA(佛波酯）和/或calcium ionophore (钙离子载体）进行诱导的过程中，随上述两种诱导剂浓度和诱导时间的增大， IFN-y的转录mRNA表达量逐渐增加；当然在达到一定的峰值之后即不再增加并且向下，但 是利用达到峰值之前线性增长的关系、以及诱导之后检测的量便可以计算回推得到原始的 表达量。
[0028] 所以基于这一情形，在本发明的试剂盒产品中也可以包含上述两种表达量诱导提 升的PMA (佛波酯）和/或calcium ionophore( |丐离子载体），辅助用于当IFN-y的转录 mRNA表达量非常低而无法直接RT-PCR检测到比较适度的结果时，采用对其表达量进行线 性放大后检测。
[0029] 基于本发明的上述引物和试剂盒，本发明还提出一种IFN-y的半定量检测方法， 包括如下步骤：
[0030] S10,获取IFN- y对照组细胞和IFN- y待测组细胞；
[0031] S20,提取IFN- y对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的 引物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列的竞争性引物P3进行RT-PCR，得到竞争模板；
[0032] S30,提取IFN- y待测组细胞的总RNA后，进行反转录获得待测cDNA模板；
[0033] S40,将待测cDNA模板和竞争模板进行混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序 列的引物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2对内标准扩增产物进行PCR ;
[0034] S50,将待测cDNA模板用具有序列表SEQ. ID. No. 4碱基序列的引物P4和具有序列 表SEQ. ID. No. 5碱基序列的引物P5进行RCR，得到对照扩增产物；
[0035] S60,根据步骤S40的扩增结果和步骤S50扩增的对照扩增产物的结果计算待测细 胞中IFN-y的mRNA量。
[0036] 上述过程完成之中，其中步骤S50和S60仅仅是一个制备参考对照和计算的过程， 这两个步骤是针对在待测细胞的RT-PCR产物没有对比参考的情形下，不能得到表达是否 正常或者是否偏高、偏低的问题。而在步骤S50和步骤S60的步骤中，为了能更加便于对比 和计算，步骤S50中PCR体系中采用待测cDNA模板的量，可以相同。这样基本模板的量相 同，便于对比计算。而步骤S40中竞争模板的量在添加的过程中要记住添加的量的多少，方 便之后的计算。
[0037] 基于上述描述，对照扩增产物扩增的是P-actin蛋白的mRNA，是一种管家基因， 在所有的细胞中都是衡量表达，采用其可以作为恒定的比对的内参值，既能得到靶片段扩 增产物的相对表达的情况。
[0038] 当然，上述方法步骤的内容，实施过程中采用的IFN-y对照组细胞一般可以采用 健康人的血样中分离的单个核细胞，而IFN-y待测组细胞可以是疑似病患或者需要确定 的血样单个核细胞，用这两者的表达进行对比即可得到待测组细胞的IFN-y的表达水平。 当然，其中由于健康人本身可能几乎不表达IFN-y，所以如果以健康人血样中分离的单个 核细胞作为对照，那么获得细胞后可能要用PMA (佛波酯）和/或calcium ionophore (?丐 离子载体）进行诱导之后才能用作对照组细胞。或者，也可以采用已经确诊病患的血样中 分离的单个核细胞，则可以不用诱导而直接作为对照组细胞。
[0039] 因此，本发明的上述方法步骤首先是可以用于组织细胞中IFN-y表达的情况，从 而进一步确定组织细胞的相关肿瘤化或者癌变的情况，助于早期的监控。但是本发明的该 方法并不仅仅用于这一情形，本发明的上述检测方法可以用于IFN-y的发酵培养中。具体 在现有的方法中，IFN-y的制备一般有两种方式，一种是从组织细胞中进行分离提取，一种 是细胞发酵培养。其中，细胞发酵培养由于其生产量大、以及易于操作等原因，适合于进行 IFN-y的大量生产制备；而其中在发酵的过程中或者发酵之前，要确认种子细胞和培养过 程中发酵细胞IFN-y的表达水平，以避免采用低表达水平的细胞培养之后产量不足的缺 陷。那么，便可以采用本发明的上述方法步骤进行种子细胞和培养过程中发酵细胞IFN-y 的表达水平的检测，检测发酵前种子细胞或者发酵过程中细胞的表达的水平，从而利于发 酵生产的产率和效益。
[0040] 当然，在上述检测的步骤S20中，也可以采用提取待测细胞的总RNA后，可以采用 添加DEPC等抑制剂进行保护，防止提取后和检测反应的过程中被降解，导致检测结果不准 确。
[0041] 当然，基于本发明的上述引物的提出，在如果已经构建有不同类型或者不同阶段 细胞表达IFN- y的情况曲线图的基础上，也可以不采用竞争性RT-PCR进行检测，而直接采 用正常的RT-PCR进行，获取待测细胞，提取总RNA后直接以具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基 序列的引物P1、具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2的引物对进行RT-PCR即可。 这一种常规RT-PCR的过程，比较通常，技术人员可以很简单的即可进行实施，这一部分本 案不再赘述。
[0042] 采用本发明的上述检测方法，与现有的免疫学测定法的方法和ELISA试剂盒的检 测相比，通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IFN- Y蛋 白产物的量，其检测的不是IFN-y分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IFN-y产生过 程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平，避免了以IFN-y蛋白产物作为直 接检测标的中IFN-y分泌、吸附、消耗和降解导致的结果差异，而不能反应细胞或组织内 实时IFN-y的表达水平。
[0043] 为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解 和实施参考，同时凸显出本发明利用IFN-y表达水平的检测的可行性和结果的准确性，以 下通过具体的实施例进行举例说明。
[0044] 实施例1
[0045] S11，制备获取健康人按常规无菌分离外周血单个核细胞菌液（大致调整细胞浓 度约为 2X106/ml);
[0046] S12,然后将上述制备的细胞菌液中加入2.0ymol/L的钙离子载体和80ng/ml PMA后，用RPMI1640完全培养液置37°C、5% 0)2分别培育7h后，离心获取细胞体进行下述 步骤；
[0047] S21，用RNA提取试剂盒提取步骤S12获取的细胞体的总RNA，提取之后添加适量 DEPC进行保护防止其降解，并用紫外分光光度计测算其吸光度值，并计算其浓度。
[0048] S22,按照步骤S21计算的浓度值后，取总RNA1. 5 y g进行反转录，反转录体系按 照如下：RNA1. 5 y g、olig〇-dT(300pmol/y 1)0. 5 y 1、dNTP(2. 5mmol/L) 1 y 1、RNasin(40U/ 4 1)0.5以1、厶1^逆转录酶（91]/^1)0.5 4 1、5\厶1^1311打6『2 4 1、用0￡?(：水补足至 lOiil ；
[0049]按照上述体系