一种用于检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对。
【背景技术】
[0002]山羊副流感病毒 3 型(Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)的成员，该病毒可导致山羊轻重不等的呼吸道感染，如感冒、咳嗽、眼鼻分泌物增加、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎等。2014年本实验室首次从表现为严重呼吸道症状的山羊临床病料中分离鉴定出该病毒(属国内外首次)，通过人工感染试验证明了该病毒对山羊的致病性。小反当兽疫(Peste des petits ruminants virus，PPRV)是副黏病毒科(Paramyxovirinae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，可导致山羊、绵羊等小反当动物发热、眼鼻出现大量分泌物、肺炎、上消化道溃疡和腹泻等临床症状，亚临床感染的山羊可通过分泌物和排泄物持续排毒。
[0003]病毒分离是检测病原的常用方法，但其耗时较长且不利于临床快速诊断，RT-PCR方法与之相比更加简便快速，适合实验室诊断。CPIV3为本实验室新发现的病毒，PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，需要通过分子生物学方法来区分两者。目前临床上仅有检测PPRV的RT-PCR方法，但是，单独检测CPIV3和同时检测CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入应用。
[0004]CPIV3基质蛋白(M)基因和PPRV核蛋白(N)基因序列高度保守，因此，针对CPIV3M蛋白基因和PPRV N蛋白基因的保守区进行双重RT-PCR检测方法的建立，能够提高RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。
【发明内容】
[0005]技术问题
[0006]本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低，能单独或/和同时检测CPIV3和PPRV的引物对；所述CPIV3为山羊副流感病毒3型，PPRV为小反刍兽疫病毒。
[0007]技术方案
[0008]本发明参考GenBank登录的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登录号:KJ850331)以及小反刍兽疫病毒N基因序列(GenBank登录号:JN647718)，利用MPprimer软件设计了 10组引物组合(共20对引物)，然后使用多因素引物特异性评估系统MFEprimer对所有引物组合进行严格的特异性评估，最终选择了未发现存在非特异性扩增的引物对组合引物对A (346bp)、引物对B (189bp)。
[0009]—种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对，其特征在于，包括引物对A和/或引物对B:
[0010]弓丨物对A，包括引物I和引物2:
[0011]引物1: 5，-GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3，；
[0012]引物2:5’ -GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’ ；
[0013]引物对B，包括引物3和引物3:
[0014]引物3:5 ’ -GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3 ’ ；
[0015]引物4:5，-TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3，。
[0016]用所述引物对A和引物对B扩增待测样本RNA，如扩增产物同时出现346bp和189bp两条条带，则待测样本为阳性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒同时存在；如扩增产物出现346bp条带，则待测样本山羊副流感病毒3型为阳性，即山羊副流感病毒3型存在；如扩增产物出现189bp条带，则待测样本小反刍兽疫病毒为阳性，即小反刍兽疫病毒存在；如扩增产物无346bp和189bp条带，判为阴性，即山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒都不存在。
[0017]用所述引物对A扩增待测样本RNA，如扩增产物出现346bp条带，则待测样本判为阳性，即山羊副流感病毒3型存在；如扩增产物无346bp，判为阴性，即山羊副流感病毒3型不存在。
[0018]用所述引物对B扩增待测样本RNA，如扩增产物出现189bp条带，则待测样本判为阳性，即小反刍兽疫病毒存在；如扩增产物无189bp，判为阴性，即小反刍兽疫病毒不存在。
[0019]所述的一种检测山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒的引物对用于检测待测样本病毒的方法，包括:
[0020](I)待测样本病毒RNA的提取:取200 μ L待测样本血清/鼻拭子溶解液，或取10mg的动物组织加入ImL PBS缓冲液进行充分研磨，_70°C反复冻融3次，12000rpm 4°C离心lOmin，取上清液200 μ L置于1.5mL的EP管中，加入Trizol试剂800 μ L，混匀后室温静置5min ;加入氯仿200 yL，振荡30s，室温静置3min，12000rpm 4°C离心15min ;转移上清至新的1.5mL的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置lOmin，12000rpm 4°C离心1min ;加入75%的乙醇ImL洗涤，12000rpm4°C离心5min，弃去液体，这时候可以看到EP管底部有少量白色沉淀，室温干燥5min ;加入RNA溶解液20 μ L溶解沉淀，即为检测用待检样品RNA ；
[0021](2)采用20 yL的RT-PCR反应体系，在0.2ml PCR反应管中分别加入2XR_MixBufferlO μ L，CPIV3 上下游引物各 0.5 μ L，PPRV 上下游引物各 0.7 μ L，E-Mix 0.4 μ L，RNA模版4 μ L，无Rnase水加至总体积，混勾；
[0022](3)扩增条件为:45 °C 反转录 40min ；94 °C 预变性 5min ；94 °C 30s，54 °C 30s，72°C 45s，共35个循环；最后72°C延伸1min ；
[0023](4)取PCR产物于I %的琼脂糖凝胶上电泳。
[0024]有益效果
[0025]本发明根据GenBank中发表的有关山羊副流感病毒3型(CPIV3)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的基因序列，经过序列比对分析，选取CPIV3M基因(GenBank登录号:KJ850331)和PPRVN基因(GenBank登录号:JN647718)中保守的片段设计并合成一对特异性引物，对CPIV3和PPRV进行RT-PCR扩增，得到约346bp和189bp的特异性条带。
[0026]本研究建立的山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒双重RT-PCR检测方法对其他常见山羊病原体(山羊痘病毒、蓝舌病病毒、边界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻病毒、伪狂犬病毒)均无反应；敏感性试验表明，最小检出量为103ng/μ L。
[0027]病毒感染山羊的血清、鼻拭子等RNA提取物用本发明建立的RT-PCR方法检测，均扩增出相应片段，适用于临床检测。
【附图说明】
[0028]图1:双重RT-PCR引物最佳量的测定结果
[0029]M表示Trans2K plus DNAMarker ;1_5泳道表示在固定CPIV3引物的量为0.5 μ L情况下，PPRV引物量分别为1.5 μ L、1.0 μ L、0.7 μ L、0.5 μ L、0.3 μ L的结果；泳道6为阴性对照。图2:双重RT-PCR最佳退火温度的测定结果
[0030]M 表示 Trans2K plus DNAMarker ;泳道 1-8 退火温度分别为 55°C、54°C、53°C、52 °C、51°C、50 °C、49 °C、48 °C ;泳道 9 为阴性对照。
[0031 ] 图3:CPIV3和PPRV双重RT-PCR扩增结果
[0032]M 表示 Trans2K plus DNAMarker ;泳道 I 为阴性对照；泳道 2 为 PPRV RT-PCR 扩增结果；泳道3为CPIV3RT-PCR扩增结果；泳道4为CPIV3和PPRV双重RT-PCR扩增结果。图4:特异性试验电泳结果图
[0033]泳道I为山羊副流感病毒3型和小反刍兽疫病毒；泳道2-7分别为:山羊痘病毒、蓝舌病病毒、边界病病毒、呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻病毒、伪狂犬病毒；泳道8为阴性对照；M 表不 Trans2Kplus DNA Marker0
[0034]图5:敏感性试验电泳结果图
[0035]M表示Trans2K plus DNA Marker ;泳道1-15为连续10倍稀释的RNA模板；泳道16为阴性对照。
【具体实施方式】
[0036]I引物设计与合成
[0037]CPIV3为本实验室新发现的病毒，此前虽已公开发表，但还没有对外公开发放，PPRV自2014年传入国内多数省区后危害巨大，二者均为引起山羊呼吸道疫病的主要病原，临床上存在混合感染，需要通过分子生物学方法来区分两者。目前临床上仅有检测PPRV的RT-PCR方法，但是，单独检测CPIV3和同时检测CPIV3和PPRV的RT-PCR方法尚未投入应用。
[0038]引物设计是决定多重PCR成败的关键。本发明通过长期研究和对本实验室新发现的病毒CPIV3的系统性研究，通过序列分析比对，分别选择CPIV3M蛋白基因和PPRVN蛋白基因的保守区进行引物设计，在确保鉴定病原正确的同时，又避免出现同种不同株病原的漏检情况。本发明所使用的引物利用多重PCR引物设计系统MPprimer软件设计完成，在设计多重引物时，除考虑单对引物的Tm值、GC含量、AG和引物是否特异等因素外，还确保了这些引物对之间有相近的Tm值，同时对各个扩增产物的大小进行了限定，保证不同的扩增产物能够很清晰地用肉眼分辨。当引物设计完成时，还需对各个引物对的特异性进行严格地审查，确保引物对不存在非特异性扩增。
[0039]参考GenBank登录的山羊副流感病毒3型M基因序列(GenBank登录号:KJ850331)以及小反刍兽疫病毒N基因序列(GenBank登录号:JN647718)，利用MPprimer软件设计了10组引物组合(共20对引物)，然后使用多因素引物特异性评估系统MFEprimer对所有引物组合进行严格的特异性评估，最终选择了未发现存在非特异性扩增的引物对组合引物对A(346bp)、引物对 B(189bp)。
[0040]引物对A:
[0041]引物1:5’ -GCAATCCACCAAAGCATGGGGT-3’，在基因组中的位置为 134_155bp ；
[0042]引物2:5’ -GGGGCAAGTGCTACTTTTTGAGCA-3’，在基因组中的位置为 456_479bp
[0043]引物对B:
[0044]引物3:5’ -GCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGT-3’，在基因组中的位置为 555_580bp ；
[0045]引物4:5’ -TGCAATCCTTGGCTTGTTGCCG-3’，在基因组中的位置为 732_753bp
[0046]2 总 RNA 提取
[0047]取200 μ L CPIV3 病毒液(16TCID5q)，(李文良等，A novel parainfluenzavirus type 3(PIV3)identified from goat herds with respiratory diseases ineastern China.Veterinary Microb1logy, 2014Nov 7 ; 174 (1-2): 100-106.)/PPRV 弱毒苗(14TCIDm) (PPRVNigeria 75/1株，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)置于1.5mL的EP管(RNase free)中，加入Trizol试剂800 μ L，混匀后室温静置5min ;加入氯仿200 μ L，振荡30s，室温静置3min，12000rpm 4°C离心15min ;转移上清至新的1.5mL的EP管(RNase free)中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后室温静置lOmin，12000rpm4°