与抗大丽轮枝菌（Verticilli皿d址liae)相关的 憐脂酶祀基因片段的RNA干扰载体及其宿主细胞；
[0007] 本发明的目的之Ξ是将所述与抗大丽轮枝菌相关的憐脂酶祀基因片段、其转录的 RNAW及含有憐脂酶祀基因片段干扰载体应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获 得抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。
[000引为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先公开了与抗大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)相关的憐脂酶革己基 因片段，其核巧酸序列为沈QIDNo. 1、沈QIDNo. 2、沈QIDNo. 3、沈QIDNo. 4、沈QID No. 5、SEQIDNo. 6或SEQIDNo. 7所示；优选的，所述憐脂酶祀基因片段的核巧酸序列为 沈QIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 6或沈QIDNo. 7所示；更优选的，所述憐脂酶祀基 因片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 6所示。
[0010] 本发明还公开了含有所述的憐脂酶祀基因片段的RNA干扰载体W及含有所述RNA 干扰载体的宿主细胞。
[0011]此外，由沈QIDNo. 1、沈QIDNo. 2、沈QIDNo. 3、沈QIDNo. 4、沈QIDNo. 5、 SEQIDNo. 6或SEQIDNo. 7所示的憐脂酶祀基因片段所转录的RNA也自然包含在本发明 的保护范围之内。
[0012] 本发明所述憐脂酶祀基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括 W下步骤：（1)构建含有所述憐脂酶祀基因的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体 转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。
[0013] 优选的，一种构建RNA干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的憐脂 酶祀基因片段连接至PD0NR207中，再通过LR反应，将其构建至地7GWIWG2(I)，〇中，得到 Gateway干扰载体。
[0014] 本发明所述RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括W下 步骤：（1)将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病 性提高的转基因植物。
[0015] 本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括W 下步骤：（1)构建含有所述憐脂酶祀基因片段的RNA干扰载体；（2)将所构建的RNA干扰 载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品 种。
[0016] 所述转化的方案W及将所述核巧酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物 细胞的类型而变化。将所述核巧酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆 菌介导的转化、直接基因转移等。
[0017] 本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：烟草、棉花、番 茄、马铃馨、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
[0018] 本发明通过病毒诱导的基因沉默技术（VIG巧将大丽轮枝菌憐脂酶基因的7段祀 基因序列VdPL4-l(SEQIDNo. 1 所示）、VdPL4-2(SEQIDNo. 2所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、VdPL6-l(SEQIDNo. 5 所示）、VdPL6-2(SEQIDNo. 6 所示）、VdPL6-3(SEQIDNo. 7所示）导入本生烟中，使其瞬时表达dsRNA，并进行大丽轮枝 菌接种，观察本生烟植株的感病症状，并对其进行病情指数分析。结果发现，导入7段祀基 因片段并产生dsRNA的本生烟植株对大丽轮枝菌的感病症状都显著低于空载注射的本生 烟植株。在接菌第12天后，导入祀基因片段的本生烟植株没有出现明显的感病症状，仅局 部出现感病症状，植株整体更没有萎黨、枯死症状；而空载注射的本生烟植株整体出现明显 的感病症状，表现出黄化、萎黨、枯死症状。同时，导入7段憐脂酶祀基因片段的本生烟植株 的抗病性增强，且导入不同祀基因的本生烟植株的感病症状之间也存在差异，导入祀基因 片段VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL6-2、VdPL6-3的本生烟植株的感病症状低于导入祀基因片段 VdPL4-l、VdPL4-4、VdPL6-l的本生烟植株，植株对大丽轮枝菌的抗病性更强。
[0019] 本发明进一步将大丽轮枝菌憐脂酶基因的屯段基因片段VdPL4-l、VdPL4-2、 VdPL4-3、VdPL4-4、VdPL6-l、VdPL6-2、VdPL6-3,利用Gateway技术，构建憐脂酶屯段祀基因 序列的稳定遗传干扰载体，转化本生烟，获得转基因的烟草植株。转祀基因的本生烟植株的 抗病性实验结果表明，接菌第十二天W后，获得憐脂酶基因干扰片段的转基因烟草植株的 感病症状极显著低于野生型植株。获得祀基因片段VdPL6-2(SEQIDNo. 6所示）的转基因 烟草植株基本没有出现感病症状，与未接菌的对照植株基本一致，植株达到免疫等级（病 情指数基本是0);获得转祀基因片段VdPL4-2(SEQIDNo. 2所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL6-3(SEQIDNo. 7所示）的烟草植株表现为高抗（病情指数在15%W下）；获 得转祀基因片段VdPL4-l(SEQIDNo. 1 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、VdPL6-l(SEQ IDNo. 5所示）的烟草植株表现为抗病（病情指数在15-30% );而野生型烟草植株出现明 显的感病症状，植株出现黄化、萎黨、枯死症状。
[0020] 转祀基因的本生烟植株中真菌生物量检测结果表明：野生型烟草植株中大丽轮枝 菌的生物量都极显著高于获得的7段不同的转憐脂酶祀基因片段烟草植株中生物量，差异 显著倍数都在10W上，有的甚至高达100倍。其中，转憐脂酶祀基因片段VdPL6-2的烟草 植株中仅仅检测到痕量大丽轮枝菌生物量，与未侵染的对照植株基本一样。
[0021] 综上，本发明所获得的憐脂酶屯段祀基因序列VdPL4-l(SEQIDNo. 1所示）、 VdPL4-2(SEQIDNo. 2 所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、 VdPL6-l(SEQIDNo. 5 所示）、VdPL6-2(SEQIDNo. 6 所示）、VdPL6-3(SEQIDNo. 7 所示） 的稳定遗传干扰载体转化本生烟，极显著提高烟草对大丽轮枝菌的抗病性。将其转入农作 物中，有望获得高抗大丽轮枝菌的新试验材料，能够应用于棉花、番茄、马铃馨、甜瓜、西瓜、 黄瓜、花生等抗病育种的实践生产中。
[0022] 本发明技术方案与现有技术相比，具有W下有益效果：
[0023] 本发明利用病毒诱导的基因沉默技术（VIG巧从7段憐脂酶基因祀基因片段筛选 到大丽轮枝菌憐脂酶基因的4段祀基因片段；进一步通过RNAi技术，构建憐脂酶基因的7 段祀基因片段的稳定遗传的干扰载体，转化本生烟，获得高抗大丽轮枝菌的烟草植株，尤其 是获得VdPL6-2祀基因片段的烟草植株的抗病性更显著，甚至达到免疫等级。本发明所述 大丽轮枝菌憐脂酶基因的7段祀基因片段W及RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮 枝菌的抗病性w及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。
[0024]本发巧所徙及到的术语定女
[0025]除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0026] 术语"多核巧酸"或"核巧酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核巧酸、脱氧核糖 核巧、核糖核巧或核糖核巧酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核巧 酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并W类似于天然产生 的核巧酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核巧酸类似物，其 包括PNA(肤核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代憐酸醋、憐酷胺酸醋等）。除 非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简 并密码子取代）和互补序列W及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个 W上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌巧残基取代的序列来实现简 并密码子取代度atzer等人，NucleicAcidRes. 19:5081(1991) ;0htsuka等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608(1985);和Cassol等人，（1992);Rossolini等人，MolCell.Probes 8:91-98(1994))〇
[0027] 术语"重组宿主细胞"或"宿主细胞"意指包含本发明核巧酸的细胞，而不管使用 何种方法进行插入W产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
[0028] 术语"RNA干扰（RNAinterference,RNAi)"意指通过外源或内源性的双链RNA在 细胞内诱导同原序列的基因表达沉默的现象。
【附图说明】
[0029] 图1为TRV1和TRV2的载体图；
[0030] 图2为7段瞬时转入本生烟中的VIGS-Vd化干扰片段本生烟植株对大丽轮枝菌的 抗病性；
[003U图3为Gateway干扰载体信息；其中，A:pD0NR207载体信息巧柿7GWIWG2 (I)，0 载体信息；
[0032]图4为本生烟草遗传转化苗的分子鉴定。分别WVdPL4-l-F/R(A)