、VdPL4-2-F/ R度）、VdPL4-3-F/R(C)、VdPL4-4-F/R值）、VdPL6-l-F/R巧）、VdPL6-2-F/R(F)、VdPL6-3-F/ R(G)、为引物，分别转VdPL4-l(A)、VdPL4-2 度）、VdPL4-3 (C)、VdPL4-4 值）、VdPL6-UE)、 VdPL6-2 (F)、VdPL6-3 (G)、祀基因的烟草转化植株的PCR分子检测。1-5 (转祀标基因烟草 植株）电泳通道分别扩增到相对应的祀基因片段，Wt(野生型植株）电泳通道均没有扩增 到祀标片段，Μ是DNAmarker;
[0033] 图5为转祀基因烟草植株的抗病性分析和真菌生物量检测分析；其中，A:转祀基 因烟草植株的病情指数统计分析；B:转祀基因烟草植株的真菌生物量检测。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但运些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0035] 1、材料
[0036] 大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)V991 :由中国农科院植保所简桂良研究员惠 赠。
[0037] 病毒载体：烟草脆裂病毒灯obaccorattlevirus,TRV)双元载体灯RV1与TRV2) 由清华大学刘玉乐教授惠赠。
[0038] 根癌农杆菌：菌株GV3101和LBA4404,由本发明人实验室保存。
[0039] 植物稳定遗传载体：PD0NR207和地7GWIWG2 (I)，0载体由本发明人实验室保存。
[0040] 实施例1VIGS-PL4、VIGS-PL6瞬时干扰载体的构建、本生烟的农杆菌注射及大丽 轮枝菌的接种
[0041] 1、实验方法
[0042]W大丽轮枝菌总RNA为模板，设计4对憐脂酶4 (化4,VDAG_09206)、3对憐脂酶 6(化6,VDAG_03089)的祀基因引物（引物序列见表1)，分别扩增憐脂酶基因的祀标区段 信息，长度约4(K)bp。扩增获得的7段片段连接到载体TRV2的多克隆位点区域（图1)，获 得重组载体TRV2-VdPL4-l，TRV2-VdPL4-2、TRV2-VdPL4-3、TRV2-VdPL4-4、TRV2-VdPL6-l、 TRV2-VdPL6-2、TRV2-VdPL6-3,测序正确后电击转化农杆菌GV3101，与TRVl(携带TRV病毒 另一部分基因信息）的农杆菌GV3101菌株1 :1混合，利用注射器将混合好的农杆菌注射于 3到5片真叶的本生烟苗的最嫩叶片中。同时WTRV2-PDS载体和TRV2空载体分别作为阳 性和阴性对照，转化农杆菌GV3101，与TRV1的农杆菌GV3101菌株1 :1混合注射本生烟。20 天后（阳性植株出现白化后），对已经侵染的本生烟植株采用薩根法接种大丽轮枝菌，观察 本生烟植株的感病症状，并对其进行病情指数分析。
[0043] 表1引物序列
[0044]
[0045]
[0046]
[0047] 2、实验结果
[0048] 本发明克隆的7段大丽轮枝菌憐脂酶基因片段VdPL4-l(SEQIDNo. 1所示）、 VdPL4-2(SEQIDNo. 2 所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、 VdPL6-l(SEQIDNo. 5 所示）、VdPL6-2(SEQIDNo. 6 所示）、VdPL6-3(SEQIDNo. 7 所示）， 导入本生烟中表达出dsRNA(接种TRV2-PDS载体的本生烟顶部出现光漂白的新叶），用大丽 轮枝菌抱子悬浮液接种已注射的本生烟。
[0049] 结果发现：导入祀基因片段并产生dsRNA的本生烟植株对大丽轮枝菌的感病症状 显著低于空载注射的本生烟植株。在接菌第十二天后，导入祀基因片段的本生烟植株没有 出现明显的感病症状，仅局部出现感病症状，植株整体更没有萎黨、枯死症状；而空载注射 的本生烟植株整体出现明显的感病症状，表现出黄化、萎黨、枯死症状。说明导入憐脂酶祀 基因片段的本生烟植株的抗病性增强。
[0050] 同时导入的7段祀基因的本生烟植株的感病症状之间也存在差异，导入基因片段 VdPL4-2(SEQIDNo. 2 所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL6-2(SEQIDNo. 6 所示）、 VdPL6-3(SEQIDNo. 7所示）的本生烟植株的感病症状低于导入基因片段VdPL4-l(SEQID No. 1 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、VdPL6-l(SEQIDNo. 5 所示）的本生烟植株，植 株对大丽轮枝菌的抗病性更强。
[0051] 对接种大丽轮枝菌的本生烟植株的病情指数统计分析结果发现：在接菌第八天、 十天、十二天W后，注射憐脂酶祀基因片段的本生烟植株的病情指数都显著低于注射空载 体的本生烟植株；同时随着天数的增加，注射憐脂酶祀基因片段的本生烟植株的病情指数 逐渐增高，但也都显著低于注射空载体的本生烟植株（图2)。
[0052] 综上结果表明，7段憐脂酶基因片段瞬时干扰的本生烟植株对大丽轮枝菌的抗病 性显著增强，植株表现为抗病性；同时7段不同的祀基因片段之间的抗病性存在差异性，导 入基因片段VdPL4-2、VdPL4-3、VdPL6-2、VdPL6-3的本生烟植株的抗病性极显著，植株表现 为高抗病性。因此，本发明通过VIGS技术筛选，获得可W提高烟草抗病性的大丽轮枝菌憐 脂酶基因祀标区段。
[0053] 实施例2憐脂酶祀基因序列的稳定遗传干扰载体构建及转化本生烟
[0054] 1、实验方法
[00巧]1. 1祀标片段的克隆和干扰载体的构建
[0056]为了获得稳定遗传的含有祀基因dsRNA的转基因植株，本发明利用Gateway技 术，将上述憐脂酶基因家族的屯段基因片段VdPL4-l(SEQIDNo. 1所示）、VdPL4-2(SEQID No. 2 所示）、VdPL4-3(SEQIDNo. 3 所示）、VdPL4-4(SEQIDNo. 4 所示）、VdPL6-l(SEQ IDNo. 5 所示）、VdPL6-2(SEQIDNo. 6 所示）、VdPL6-3(SEQIDNo. 7 所示）为祀基因，长 度约300bp。设计屯段两端含有BP位点的引物VdPL4-l-F/R，VdPL4-2-F/R，VdPL4-3-F/ R，VdPL4-4-F/R，VdPL6-l-F/R，VdPL6-2-F/R，VdPL6-3-F/R(引物序列见表 1)，在 5' 端加入了attBl位点部分序列（aaaaaagcaggct)，在3'端加入了attB2位点序列 (aagaaagctgggt)，用于Gateway干扰载体的构建（引物信息见表1)。W大丽轮枝菌的 总RNA为模板，分别扩增7段憐脂酶基因家族的祀基因片段，再用完整的attB位点序列attB-F/R为引物（引物序列见表1)，W上面的目的片段为模板，扩增带有完整attB位点的 目标片段，连接祀ASY-T1载体，测序正确后用于Gateway方法构建RNAi载体。构建Gateway 干扰表达载体需要发生W下两个反应：（1)BP反应：采用入口载体pD0NR?207(图3)，具有 Gent抗性和CC地致死基因（CC地基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制 标准大肠杆菌宿主的生长，当目的载体和入口克隆发生重组时，CC地基因被目的基因取代， 携带有CC地基因的未反应载体或保留有CC地基因副产品的细胞将不会生长），具有attP 重组位点。BP反应参照invitrogn公司的Gakwiiyi彩BPClonase''咬IIBizymemix(美国） 说明书操作，反应载体为带有attB位点的祀ASY-Tl载体与带有attP重组位点的入口载体pD0NR?207在25°C反应4h生成具有attL重组位点的中间载体，（2)LR反应：采用的干扰载 体是地7GWIWG2 (I)，0 (图3)，具有Spe抗性和CC地致死基因，具有attR重组位点。LR反 应参照invitro即公司的Ga化Wily巧LRCIott设能蠻.ΠEnzymemix(美国）说明书操作， 反应载体为发生BP反应生成的具有attL重组位点的中间载体与干扰载体地7GWIWG2 (I)，0 在25°C反应地生成具有attB重组位点且含有憐脂酶祀基因片段的干扰载体。
[0057] 通过BP反应和LR反应，将克隆获得的憐脂酶基因家族的7段祀基因片段构建到 Gateway干扰载体地7GWIWG2 (I)，0上，形成含有真菌祀基因的植物转化载体。电击法将获 得含有祀基因片段的干扰载体转化农杆菌LBA4404,用于本生烟等植株的遗传转化。
[0058] 1. 2本生烟草的遗传转化与分子鉴定
[0059] 将种在MS基本培养基上的无菌的烟草，除去叶片边缘和主要叶脉，切成 0. 4X0. 6cm大小的小段。将切好的外植体在上述ODe。。为0. 1~0. 2的农杆菌菌液中浸泡 5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶片摆放在铺有一层滤纸的烟草芽分化 培养基（MS+NAA0. 2mg/L+6-BA2mg/L)上进行共培养，25°C暗培养3天。
[0060] 将经过共培养的烟草外植体转移到含有抗生素的抗性