[0025] 本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，DNA链之间的碱基互补配对原则， 杂交链反应以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速 度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补有机磷农药现有检测方法的缺陷与不足，实现 对其快速，准确的定量检测，具体反应原理图如图1。
[0026] 实施例1 电极修饰过程的主要步骤如下： a、 金电极首先在0. 3和0. 05 的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二 次水反复冲洗； b、 将10 μ L的CP (1 μ M)滴加到电极表面，在37°C孵育2h。通过Au-S键将捕获探 针固定到电极表面； 至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中 的主要步骤： 已、将灭菌水，5\的卩85、不同浓度的拖1口61(0.14]\1，0.2 4]\1，0.5 4]\1，14]\1，1.5 μΜ，2 μΜ)，Aptamerd μΜ)和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱 中孵育2h。
[0027] b、将孵育好的混合溶液与HAPl (10 μ M)，HAP2 (10 μ Μ)滴加到修饰好CP的电 极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2h。
[0028] c、将孵育好的电极浸没在含有MB的溶液中孵育lOmin，使MB浸入杂交双链的凹槽 中； d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次lOmin，共清洗3次。
[0029] 以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0. 5 V，脉冲宽度 0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
[0030] 上述过程中用到的溶液的制备方法： PBS 缓冲液是由以下方法配制：Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM), NaCl (140 mM), KCl (I mM), MgCl2 (I mM), CaCl2 (I mM),最终溶液的 pH 值为 7. 4。
[0031] 配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯 水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箱纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 °C 的温度下灭菌20 min。
[0032] 结果见图2,从图中可以看出，检测到的电流信号随着Helper的浓度在0. 1-1 μΜ 区间内增大而增大，当浓度超过1 μΜ后，电流趋于稳定。所以Helper的最佳浓度为1 μΜ。
[0033] 实施例2 电极修饰过程的主要步骤如下： a、金电极首先在0. 3和0. 05 的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二 次水反复冲洗； 13、将10 41^不同浓度的〇卩（0.14]?，0.2 4]\1，0.5 4]\1，14]\1，1.5 4]\1，2 4]\〇滴加 到电极表面，在37°C孵育2h。通过Au-S键将捕获探针固定到电极表面； 至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中 的主要步骤： a、将灭菌水，5X的PBS、Helper (I yM)，Aptamer (1 μΜ)和待测目标物加入离心管 中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h。
[0034] b、将孵育好的混合溶液与HAPl (10 μ M)，HAP2 (10 μ Μ)滴加到修饰好CP的电 极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2h。
[0035] c、将孵育好的电极浸没在含有MB的溶液中孵育lOmin，使MB浸入杂交双链的凹槽 中； d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次lOmin，共清洗3次。
[0036] 以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0. 5 V，脉冲宽度 0.05V，扫描速率0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。
[0037] 上述过程中用到的溶液的制备方法： PBS 缓冲液是由方法配制：Na2HP04 (10 禮)，NaH2PO4 (10 mM), NaCl (140 mM), KCl (1 mM)，MgCl2 (I mM)，CaCl2 (I mM)，最终溶液的 pH 值为 7. 4。
[0038] 配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯 水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箱纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 °C 的温度下灭菌20 min。
[0039] 结果见图3,从图中可以看出，检测到的电流信号随着CP的浓度在0. 1-1 μΜ区间 内增大而增大，当浓度超过ΙμΜ后，电流趋于稳定。所以CP的最佳浓度为1 μΜ。
[0040] 实施例3 电极修饰过程的主要步骤如下： a、 金电极首先在0. 3和0. 05 的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二 次水反复冲洗； b、 将10 μ L的CP (1 μ M)滴加到电极表面，在37°C孵育2h。通过Au-S键将捕获探 针固定到电极表面； 至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中 的主要步骤： a、将灭菌水，5X的PBS、Helper (I yM)，Aptamer (1 μΜ)和不同浓度待测目标物加 入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h。
[0041] b、将孵育好的混合溶液与HAPl (10 μ M)，HAP2 (10 μ Μ)滴加到修饰好CP的电 极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2h。
[0042] c、将孵育好的电极浸没在含有MB的溶液中孵育lOmin，使MB浸入杂交双链的凹槽 中； d、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次lOmin，共清洗3次。
[0043] 以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0. 5 V，脉冲宽度 0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。检 测结果如下表所示，我们可以看到，在水胺硫磷的浓度在100 PM到100 nM时，水胺硫磷浓 度的对数与电流大小成正比关系，同时，我们在100 PM的浓度基础上继续向更低的浓度检 测，经检测当浓度低于100 PM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即电流最 低点因此可得到该方法的检测下限为84 pM。
【主权项】
1. 一种基于核酸适配体检测水胺硫磷的电化学传感器，其特征在于，包括以下步骤： (1) 对电极进行预处理； (2) 将CP修饰到电极表面； (3) 将均相反应产物与HAP1，HAP2修饰到电极表面。2. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（2)中具体操作为将10μL 的浓度为1μΜ的CP溶液滴加到经过预处理的电极表面，在37°C下孵育2h。3. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（3)中，将均相反应产物修 饰到电极表面的操作步骤如下： 将灭菌水，5X的PBS、浓度分别为1μΜ的Aptamer和Helper和待测目标物加入离心 管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h;再与浓度分别为10μΜ的HAP1和HAP2滴加 到修饰好的CP的电极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2h，清洗。4. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，步骤（1)中具体操作为：电极在 0. 3和0. 05Mm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。5. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述电极为金电极。
【专利摘要】本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测水胺硫磷的电化学传感器。具体制备方法为：对电极进行预处理；将CP层修饰到电极表面；将均相反应混合液与HAP1，HAP2修饰到电极表面。本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用水胺硫磷的aptamer作为识别物质实现了对目标物水胺硫磷的高特异性检测；利用杂交链反应放大技术，实现了信号的放大，提高了传感器的灵敏度。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N27/327
【公开号】CN105385753
【申请号】CN201510686257
【发明人】刘素, 黄加栋, 王玉, 王虹智, 郭玉娜, 许颖, 邱婷婷, 崔洁, 崔雪君, 冷雪琪, 韩聪, 裴倩倩
【申请人】济南大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月22日