划线在YH)上并使其过夜生长，然后将其划线在5-F0A平板上以允 许在步骤3中引入的URA3标记的丢失。一种所选择的5-F0A抗性转化体被表示为ML14093。
[0425] 使用正向引物ATTATTAAGCTTcgacattgaggtggaggaga(SEQIDN0 :247)和反向引物 TAATAAACGCGTtgctgctggatttcgttgac(SEQ ID N0:248)，由Y. lipolytica基因组通过PCR扩 增GSY1基因 （SEQ ID N0:246的第1001-3073)的1008bp内部片段。将该内部GSY1片段克隆在 恰当的载体中。利用BstEII来使产生的载体MB4691_YALI0F18502g(图16)线性化，对于 BstEII而言，克隆的PCR片段中存在唯一的限制位点。在矿质培养基上转化和选择之后，利 用诊断PCR来检验转化体中的正确的整合。图17中阐释了 GSY1基因的破坏。
[0426] 实施例13:利用Y. lipolytica gsyl破坏菌株的发酉孝实验
[0427]用来自YEH)琼脂的菌落材料接种预培养物。使预培养物在含有葡萄糖作为碳源的 800μ1 YEP中生长。在Infors培养箱中，在30°C、800rpm和80%湿度下孵育预培养物72小时。
[0428]使用40μ1预培养物来接种含有葡萄糖作为碳源的2.5ml YEP。在Infors培养箱中， 在30°C、800rpm和80%湿度下孵育主培养物120小时。离心培养物并使用LC/MS来分析上清 液中的RebA。RebA(RV0141-94，DAEPyungCo.Ltd)被用作标准品。
[0429]将gsyl破坏菌株与原养型前体菌株ML14032相比。我们发现：相较于亲本菌株，所 述具有gsyl破坏的菌株产生较高的RebA滴度，大概高50%。结果概述请参见表10。
[0430] 表10.莱鲍迪甙A生产
[0431]
[0432] 表1:序列表说明
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438]
[0439] 灰色的id是截短的，因此它们是所提及的UniProt id的片段。
【主权项】
1. 包含一种或更多种核苷酸序列的重组微生物，所述一种或更多种核苷酸序列编码： 具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽； 具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽； 具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽;和 具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产甜菊醇，以及 其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使得其导致以下中的一种或更多种的产生 缺陷： (i) 能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(GOH)的形成的磷 酉支酶； (ii) 能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸酶； (1^)外-1，3-0葡聚糖酶； (iv) 糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽）； (v) 缺氧基因的转录抑制子(R0X1) (vi)NADPH氧化酶;或者 (vii) 单羧酸转运体(JEN1) (viii) 具有由开放阅读框γ几064w编码的活性的多肽;或者 (ix) 具有由开放阅读框YPL062W编码的活性的多肽。2. 根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使得 其导致以下中的一种或更多种的产生缺陷： (i) 能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(GOH)的形成的磷 酸酶，其包含与SEQIDNO:225的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列； (ii) 能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸酶，其 包含与SEQIDNO:227的序列同一性为至少约30%的氨基酸序列； (iii) 外-1，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQIDN0:229或231的序列同一性为至少约30% 的氨基酸序列； (iv) 糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQIDN0:233、235或250的序列 同一性为至少约30 %的氨基酸序列； (v) 缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQIDN0:237的序列同一性为至少约30%的氨 基酸序列； (vi)NADPH氧化酶，其包含与SEQIDN0:239的序列同一性为至少约30%的氨基酸序 列； (vii) 单羧酸转运体，其包含与SEQIDN0:241的序列同一性为至少约30%的氨基酸序 列； (viii) 具有由开放阅读框YJL064W编码的活性的多肽，其包含与SEQIDN0:243的序列 同一性为至少约30 %的氨基酸序列;或者 (ix) 具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQIDN0:245的序列同 一性为至少约30 %的氨基酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的重组微生物，其中所述重组微生物的基因组在以下一个或 更多个中的至少一个位置处已经被修饰： (i) 核酸，其编码能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(GOH) 形成的磷酸酶，其包含与SEQIDNO:224的序列同一性为至少约60%的核酸序列； (ii) 核酸，其编码能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇形成的 磷酸酶，其包含与SEQIDNO:226的序列同一性为至少约60%的核酸序列； (iii) 核酸，其编码外-1，3-β葡聚糖酶，其包含与SEQIDN0:228或230的序列同一性为 至少约60 %的核酸序列； (iv) 核酸，其编码糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽），其包含与SEQIDN0:232、234 或249的序列同一性为至少约60 %的核酸序列； (v) 核酸，其编码缺氧基因的转录抑制子，其包含与SEQIDN0:236的序列同一性为至 少约60 %的核酸序列； (vi) 核酸，其编码NADPH氧化酶，其包含与SEQIDN0:238的序列同一性为至少约60% 的核酸序列； (vii) 核酸，其编码单羧酸转运体，其包含与SEQIDN0:240的序列同一性为至少约 60%的核酸序列； (viii)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL0 6 4w编码的活性的多肽，其包含与SEQID NO: 242的序列同一性为至少约60 %的氨基酸序列;或者 (ix)核酸，其编码具有由开放阅读框YJL062W编码的活性的多肽，其包含与SEQIDNO: 244的序列同一性为至少约60 %的氨基酸序列。4. 根据在前权利要求中任一项所述的重组微生物，其中多肽产生的所述缺陷为产生减 少至少约40 %。5. 根据在前权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含一种或更多种 核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶活性的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物能够生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷 或莱鲍迪戒A、莱鲍迪戒B、莱鲍迪戒C、莱鲍迪戒D、莱鲍迪戒E、莱鲍迪戒F、甜茶苷、杜克戒A 中的至少一种。6. 根据权利要求5所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序 列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产甜菊单糖苷。7. 根据权利要求5或6所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸序列，所述核苷 酸序列编码能够催化在甜菊醇或甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产甜菊双糖苷。8. 根据权利要求5-7中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸序 列，所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产甜菊苷。9. 根据权利要求5-8中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸序 列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3'的葡糖基化的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产莱鲍迪甙A。10. 根据权利要求5-9中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸序 列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱鲍迪甙A的葡糖基化的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产莱鲍迪甙D。11. 根据权利要求5-10中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸 序列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的葡糖基化的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产莱鲍迪甙E。12. 根据权利要求5-11中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包含核苷酸 序列，所述核苷酸序列编码能够催化莱鲍迪甙E的葡糖基化的多肽， 通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物至少能够生产莱鲍迪甙D。13. 根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达核 苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽。14. 根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其能够表达以下中的一种或 更多种： a. 编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 包括： i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID从):2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列； ii·与SEQIDN0:l、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或 184的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列， b. 编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括： i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID NO: 10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列；ii·与SEQIDN0:9、ll、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183 或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列， c. 编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包 括： i. 编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID NO: 22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20 %的氨基酸序列； ii. 与SEQID如：21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列 同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于或（iii)的核酸分子序列的核苷酸序列； 或者 d. 编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包 括： i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID N0:28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序 列； ii·与SEQIDNO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185的核 苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。15. 根据权利要求5-14中的任意一项所述的重组微生物，其能够表达核苷酸序列，所述 核苷酸序列编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列包 括： i. 编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与 SEQIDNO:36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列； ii. 与SEQID勵:35、37、71、147、168、169、189的核苷酸序列的序列同一性至少约15% 的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。16. 根据权利要求5-15中的任意一项所述的重组微生物，其能够表达核苷酸序列，所述 核苷酸序列编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列 包括： i.编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包 含与SEQIDNO:88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约 20%的氨基酸序列； ii.与SEQID勵:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同 一"性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。17. 根据权利要求5-16中的任意一项所述的重组微生物，其能够表达核苷酸序列，所述 核苷酸序列编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列 包括： v. 编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包 含与SEQID^):40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序 列； vi·与SEQIDN0:39、41、43、45、47、73、148、170、171、172、173、174或190的核苷酸序列 的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； vii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 viii. 由于遗传密码的简并性而不同于或（iii)的核酸分子序列的核苷酸序 列。18. 根据权利要求5-17中的任意一项所述的重组微生物，其表达核苷酸序列，所述核苷 酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3'的葡糖基化的多肽，其中所述核苷酸序 列包括： i. 编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3'的葡糖基化的多肽的核苷酸序列，所述 多肽包含与SEQIDNO:50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列； ii. 与SEQIDN0:49、51或75、149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约 15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。19. 根据权利要求5-18中的任意一项所述的重组微生物，其表达核苷酸序列，所述核苷 酸序列编码能够催化以下中的一种或更多种的多肽:将甜菊苷或莱鲍迪甙A葡糖基化为莱 鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍迪甙D，其中所 述核苷酸序列包括： i. 编码能够催化以下中的一种或更多种的多肽的核苷酸序列：将甜菊苷或莱鲍迪甙A 葡糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍 迪甙D，所述多肽包含与SEQIDNO:88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序 列同一性至少约20 %的氨基酸序列； ii. 与SEQID勵:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同 一"性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。20. 根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物属于以述属 之一：Saccharomyces、Aspergi1lus、Pichia、Kluyveromyces、Candida、Hansenula、 Humicola、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen、Yarrowia、Yamadazyma或 Escherichia。21. 根据权利要求20所述的重组微生物，其中所述微生物是Saccharomyces cerevisiae细胞、Yarrowialipolitica细胞或Escherichiacoli细胞。22. 根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生香叶基 香叶基二磷酸(GGPP)的能力被上调。23. 根据权利要求22所述的重组微生物，其包含编码羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶、法尼 基焦磷酸合酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的一种或更多种核苷酸序列，通过所述核苷酸序 列的表达使所述微生物能够生产水平提高的GGPP。24. 根据权利要求22或23所述的重组微生物，其能够表达以下中的一种或更多种： a. 编码具有羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序 列包括： i. 编码具有羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与 SEQIDNO:80的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列； ii. 与SEQIDN0:79的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列， b. 编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括： i.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID NO:82的氨基酸序列的序列同一性至少约20 %的氨基酸序列； ii. 与SEQIDN0:81的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，或者 c.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 包括： i. 编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ IDNO:84的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列； ii. 与SEQIDN0:83的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列； iii. 其互补链与序列（i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者 iv. 由于遗传密码的简并性而不同于(i)、（ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。25. 制备二萜或糖基化的二萜的方法，其包括在合适的发酵培养基中发酵根据在前权 利要求中的任一项所述的微生物；以及任选地回收二萜或糖基化的二萜。26. 制备二萜或糖基化的二萜的方法，所述方法包括在约29°C或更低的温度下，在合适 的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生物；以及任选地回收二萜或 糖基化的二萜。27. 根据权利要求26所述的制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中在约28°C或更低的 温度下实施所述发酵。28. 根据权利要求26或27所述的制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中在约27°C或更 低的温度下实施所述发酵。29. 根据权利要求26-28中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中在约 26°C或更低的温度下实施所述发酵。30. 根据权利要求26-29中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述 重组微生物是根据权利要求1-24中的任一项所述的重组微生物。31. 根据权利要求25-30中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中以工 业规模实施所述方法。32. 发酵液，其包含通过根据权利要求25-31中的任一项所述的方法能够得到的二萜或 糖基化的二萜。33. 二萜或糖基化的二萜，其是通过根据权利要求25-31中的任一项所述的方法得到 的，或者其能够从根据权利要求32所述的发酵液获得。34. 根据权利要求33所述的二萜或糖基化的二萜，其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。35. 包含根据权利要求33或34所述的二萜或糖基化的二萜的食品、饲料或饮料。36. 将第一糖基化的二萜转换为第二糖基化的二萜的方法，所述方法包括： 将所述第一糖基化的二萜与根据权利要求1-24中的任一项所述的微生物、来源于这种 微生物的无细胞提取物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触， 从而将所述第一糖基化的二萜转换为所述第二糖基化的二萜。37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述第二糖基化的二萜是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙 D〇38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述第一糖基化的二萜是莱鲍迪甙A，以及所述
【专利摘要】本发明涉及包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序列编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽、具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽、具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽和具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使微生物至少能够生产甜菊醇，且其中所述重组微生物的基因组已经被修饰，使得其导致以下中的一种或多种的产生缺陷：(i)能够作用于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)从而导致香叶基香叶醇(GOH)的形成的磷酸酶；(ii)能够作用于法尼基焦磷酸(FPP)从而导致法尼醇和橙花叔醇的形成的磷酸酶；(iii)外-1，3-P葡聚糖酶；(iv)糖原合酶(或者影响糖原积累的多肽)；(v)缺氧基因的转录抑制子(ROX1)；(vi)NADPH氧化酶；或者(vii)单羧酸转运体(JEN1)；(viii)具有由开放阅读框YJL064w编码的活性的多肽；或者(ix)具有由开放阅读框YPL062w编码的活性的多肽。所述重组微生物还可以能够表达一种或多种UDP-葡糖基转移酶，从而使微生物能够产生一种或多种甜菊糖苷。
【IPC分类】C12P15/00, A23L2/60, A23L27/30, C12N9/02, C12N9/88, C12N9/10, C12N9/16, C12N15/52, C12N9/90, C12P19/56, C07K14/395, C12N9/24, C07K14/39
【公开号】CN105452476
【申请号】CN201480035125
【发明人】维克托·马里厄斯·波尔, 欧文·苏尔
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年6月2日
【公告号】CA2913876A1, EP3004366A2, US20160177360, WO2014191581A2, WO2014191581A3