26] (一)本发明仅通过简单的PCR酶切位点引入W及连接转化即构建得到双T-DNA载 体。将该载体用于植物转基因，在Τι代便可得到无选择标记的转基因安全植株。
[0027] (二)本发明将报告基因 GUS基因和筛选基因抗潮霉素基因串联，将GFP基因和目的 基因串联，分别连入两个独立的T-DNA区，在后续的转基因检测中仅需要对报告基因进行直 接检测就能快速、准确的检测出转基因后代植株，避免了使用假阳性高的PCRW及操作不便 且高成本的Southern杂交。
[002引 （Ξ)本发明中GUS和GFP基因分别存在于两个T-DNA中，同时检测两种报告基因，便 可w简便直观地从转基因后代植株中准确快速的筛选出目的基因与选择标记基因发生分 离的植株(仅含GFP基因），从而简单快速剔除目的基因与选择标记基因发生共整合的转基 因植株(同时含有GUS、GFP基因）。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例1中PCR扩增片段LB和N0S的电泳检测结果；l.MarkerIII;2-6. 目的片段N0S;7-11.目的片段LB。
[0030] 图2为本发明实施例1中载体A的酶切验证电泳结果；1.Marker III ;2.酶切样品； 3.载体A。
[0031] 图3为本发明实施例2中PCR扩增两个独立UBI片段的电泳检测结果；1.Marker III;2-6.目的片段UBI-1;7-11.目的片段UBI-2。
[0032] 图4为本发明实施例3中PCR扩增两个独立RB片段的电泳检测结果；1 .Marker III; 2-4.目的片段RB-l;5-7.目的片段RB-2。
[003引图5为本发明实施例4中PCR扩增GUS156和N0S Poly片段的电泳检测结果； l.MarkerIII;2-6.目的片段GUS156;7-11.目的片段N0S Poly。
[0034] 图6为本发明实施例1中载体A的质粒图谱。
[0035] 图7为本发明实施例2中载体B的质粒图谱。
[0036] 图8为本发明实施例3中载体C的质粒图谱。
[0037] 图9为本发明实施例4中载体D (双T-DNA载体)的质粒图谱。
[003引图10为本发明实施例5中转基因烟草Τι代GUS染色图；a、c为非阳性植株;b、d图为 阳性转基因植株。
[0039] 图11为本发明实施例5中转基因烟草Τι代GFP基因 PCR检测结果；l.MarkerI;2-10. 转基因烟草DM检测；11.非转基因烟草阴性对照；12.质粒阳性对照。
【具体实施方式】
[0040] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0041 ] W下实施例使用的pMD 19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，T4连接酶购自 肥B公司，限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。D册α制备试剂购自北京全式金生 物技术有限公司。
[0042] GUS 染液配方：X-GLUC 染色液：50mmol/L 憐酸钢缓冲液（pH 7.0) ; lOmmol/L NasEDTA(抑=8.0);0.5mmol/L K3[Fe(CN)6] ;0.5mmol/L K4[Fe(CN)6] ;0.1 %Triton-X100; 0.8g/L X-Gluco
[0043] D册a感受态细胞制备流程:取-80°C保存的D册a空菌在空白LB平板上活化，取单菌 落用LB液体培养基扩繁，测定菌液0D值到0.5停止摇菌，按每管1ml的量将菌液加入遇冷的 1.5ml离屯、管中，4°C，4000转每分钟离屯、lOmin，取出在冰上将上清尽可能去除干净，按每管 100化的量加入遇冷的solution I轻柔打匀菌体，4°C，4000转每分钟离屯、lOmin，取出在冰 上将上清尽可能去除干净，按每管10化L的量加入遇冷的solution II轻柔打匀菌体，放到- 80°C保存备用。
[0044] 实施例1含有两个独立左边界LB序列的载体A的构建
[0045] 1、设计引物扩增增终止子N0S和左边界LB
[0046] 根据已公布的PCMBIA1302载体的序列（GenBank:AF2：34298.1)，设计扩增终止子 N0S的引物，引物中包括限制性酶切位点Bstell和BamHI，序列见沈Q ID N0:1，沈Q ID NO: 2;设计扩增左边界LB的引物，引物中包括限制性酶切位点BglΠ 和SphI，其中BamHI和BglII 是同尾酶。序列见SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4。引物由上海英俊公司合成。
[0047] WpCAMBIA1302为模板，W沈Q ID N0:1和沈Q ID側:2为引物进行口0?扩增側5，即 沈Q ID N0:5,目的片段约为273bp(图1)。^沈Q ID N0:3和SEQ ID N0:4为引物进行PCR扩 增LB，即沈Q ID N0:6,目的片段约为170bp(图1)。对扩增产物进行胶回收，连接PMD19-T载 体，16°C连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，筛选阳性克隆。测序并 命名为T-N0S和T-LB。
[004引2、含有两个LB边界载体的验证
[0049] 将经过测序验证的含有目的片段沈9 10^:5和沈9 10^:6的质粒1'-^5和1'寸8 分别在37°C下用83*611，83111阳和8旨111，59}11进行双酶切，将酶切产物跑胶分别回收1686口 和15化P的片段；同时，将骨架载体PCMBIA1302在37°C下经Bstell和SphI双酶切后跑胶回收 大的载体片段。两条目的片段和一条载体片段在T4连接酶的作用下22°C连接过夜。将连接 产物转化大肠杆菌感受态细胞，WSEQ ID N0:1和SEQ ID N0:4为引物进行PCR鉴定，若N0S 和LB连入载体，则扩增出443bp的片段，然后将阳性克隆摇菌提取质粒，用Bstell和SphI双 酶切得到一条与预期大小一致的片段（图2)。最后进行测序验证，将测序正确的载体命名A (图 6)。
[0050] 实施例2含有两个背对UBI启动子序列的载体B的构建
[0051] 1、设计引物扩增两个独立的UBI启动子片段
[0052]根据已公布的BinaiT vector pGA1611 载体的序列（GenBank:AY373338.1)，设计 扩增两个独立的UBI启动子片段的引物，该引物按照同源重组引物要求设计，序列见SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10;在引物沈Q ID NO: 8和9中引入酶切位点 Sal I ο
[0053] W含有UBI启动子的载体为模板，WSEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行PCR扩 增册1-1，即沈9 10^:11，目的片段约为20506口（图3)。^沈9 10^:9和沈9 10^:10为 引物进行PCR扩增UBI-2,即SEQ ID N0:12,目的片段约为2063bp(图3)。对扩增产物进行切 胶回收。
[0化4] 2、同源重组连接及测序验证
[0055] 对实施例1中得到的载体进行BamHI和Spel双酶切过胶回收大片段，与步骤1回收 到的两个独立UBI片段采用同源重组的方法进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细 胞，W沈Q ID N0:7，SEQ ID N0:8和沈Q ID N0:9，SEQ ID ^:10为引物进行口〇?鉴定，若同 时扩增出SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇 菌提取质粒，送公司进行测序验证，将测序正确的载体命名B(图7)。
[0056] 实施例3含有两个右边界RB序列的载体C的构建
[0化7] 1、两个独立的RB片段的PCR扩增
[0化引根据已公布的PCMBIA1302载体的序列（GenBank:AF234298.1)，设计同源重组引物 扩增两个独立的38-1，1^-2片段，引物序列分别为569 10^:13,569 10顯：14和沈9 10 NO:15,沈Q ID NO:16。
[0059] ^9〔418141302为模板，^沈9 10^:13，沈9 10^:14为引物进行?0?扩增得到 RB-1片段，序列编号为SEQ ID N0:17,目的片段约为179bp(图4)。^和SEQ ID N0:15，SEQ 10^:16为引物进行口〇?扩增得到1^-2片段，即沈9 10^:18，目的片段约为1736口（图4)。 对扩增产物进行胶回收。
[0060] 2、同源重组连接及测序验证
[0061] 对实施例2中得到的载体进行Sail单酶切过胶回收，与步骤1回收到的两个独立RB 片段采用同源重组的方法进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，WSEQ ID NO: 13,569 10顯：14和沈9 10顯：15,569 10顯：16为引物进行口〔3鉴定，若同时扩增出569 ID NO: 17，SEQ ID NO: 18对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇菌提取质粒， 送公司进行测序验证，将测序正确的载体命名C(图8)。
[0062] 实施例4双T-DNA载体的构建
[0063] UGUS156基因和Nos poly-A片段的PCR扩增
[0064] 根据已公布的Bina巧 vector P化EAN-G156的序列（GenBank:JN654719.1)，设计 同源重组引物扩增GUS156基因和Nos poly-A片