段，引物序列分别为沈Q ID N0:19，SEQ ID NO:20和沈Q ID NO:21，沈Q ID NO:22，
[0065] W含有GUS基因的载体为模板，WSEQ ID N0:19，SEQ ID N0:20为引物进行PCR扩 增得到Nos poly-A片段，序列编号为SEQ ID N0:23,目的片段约为313bp(图5)dW和SEQ ID N0:21，沈Q ID N0:22为引物进行PCR扩增得到GUS156片段，即沈Q ID N0:24,目的片段约为 210化p(图5)。对扩增产物进行胶回收。
[0066] 2、同源重组连接
[0067] 对实施例3中得到的载体C进行ΚρηΙ单酶切，过胶回收，与步骤1中得到的两个片段 进行多片段同源重组，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，WSEQ ID NO: 19，SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22为引物进行PCR鉴定，若同时扩增出沈Q ID NO:23，SEQ ID N0:24对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇菌提取质粒，送公司进行测序 验证，将测序正确的载体命名D(图9)，即可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体。
[0068] 实施例5双T-DNA载体的遗传转化及后代植株阳性筛选 [00例 D载体(即双T-DNA载体)叶盘法转化烟草(常规叶盘法）
[0070] 1)采用电击转化法(方法参考分子克隆:实验手册），将重组质粒D导入根癌农杆菌 AGL1的感受态细胞，经筛选鉴定为阳性的重组子命名为AGL1-D。
[0071 ] 2)采用叶盘法将重组子转化烟草，具体操作步骤如下：
[0072] a.取培养基中培养的无菌烟草苗幼嫩健康的叶片。
[0073] b.挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到3-5ml含利福平和卡那霉素抗生素的MG/L 培养液中，在28°C、200rpm恒溫摇床上培养。取W上培养菌液按1%的比例，转入新鲜的含利 福平和卡那霉素抗生素的MG/L培养液中，继续培养8-12小时，当0D值为0.4-0.6时即可用于 转化。
[0074] C.将步骤b中的菌液3000巧m离屯、lOmin，用MS液体培养基重悬，在b培养条件下培 养1-化。
[0075] d.在无菌环境中，将菌液倒入无菌小培养皿，添加终浓度为120皿/L的乙酷下香 酬，将无菌叶片剪成0.5cm X 0.5cm的小块，放入菌液中泡6-8分钟，期间轻微晃动培养皿，保 证所有叶片菌侵入菌液。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后接种在表面放有 一层无菌滤纸的MS培养基上，28°C暗培养3天。
[0076] e .将经过共培养的外植体转移到含2 .Omg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，40mg/L潮霉素和 150mg/L Timentin的MS培养基上。在光照的条件下，25°C进行选择培养。
[0077] f.选择培养2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到含有40mg/L 潮霉素和150mg/L Timentin的MS培养基上进行生根培养。
[0078] g.两周左右长出不定根，然后移栽到±壤中。
[0079] 3)转基因烟草阳性植株的检测
[0080] W上得到的具有潮霉素抗性的转基因烟草阳性植株包括Ξ种情况，一种为只有选 择标记基因转入植株;第二种为选择标记基因和GFP基因共整合到染色体同一位置;第Ξ种 为选择标记基因和GFP基因共整合到染色体的的不同位置。其中第Ξ种是可W通过后代自 交分离得到无选择标记的转基因植株。通过GUS染色和GFP检测可W筛选到第二种和第Ξ种 情况的转基因植株。
[0081 ] 具体方法如下；
[00剧①.GUS染色
[0083] 取再生植株的叶片进行GUS染色，将准备好的叶片放入EP管中，加入X-GLUC染色液 浸没叶片，封好盖子;放入37°C培养箱溫浴1-12h;倒掉侵染液加入70 %乙醇脱色2-3次，去 除叶绿素至阴性对照为白色为止，观察叶片颜色。
[0084] ②.GFP 检测
[0085] 取再生植株的叶片或根尖制作切片；使用巧光显微镜在紫外或488nm波长蓝光激 发下，观察GFP的表达;设计引物对植株基因组DNA进行PCR检测。
[0086] 4)无选择标记转基因植株的获得
[0087] 采用GUS染色和GFP观察的方法，对经潮霉素筛选存活的30株烟草再生植株进行检 测，结果如下：13株再生烟草苗只检巧蝴GUS基因的表达（图10)，图10为采用同类植株幼苗 染色所得，实验用9株筛选存活苗全部种植，采用叶片染色W及叶片DNA提取用于后续验证； 17株再生烟草苗同时检测到GUS基因和GFP基因的存在（图10和图11)，此类植株可W通过 Τ2-Τη代筛选只有GFP基因而不携带潮霉素抗性的安全植株。该结果表明，本发明所构建的双 报告基因双T-DNA载体可用于获得无标记基因的安全植株。
[0088] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其特征在于，其是将报告基因 GUS和抗性筛选 标记基因串联，将荧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联序列分别连入两个独立 的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体上构建得到的。2. 根据权利要求1所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述抗性筛选标记基因包括抗生 素抗性基因和抗除草剂基因；所述抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因； 所述荧光报告基因包括GFP、RFP、YFP、BFP以及它们的增强型基因。3. 根据权利要求1或2所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述植物双元表达载体为 pCAMBIA1302〇4. 根据权利要求3所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述双T-DNA载体的核苷酸序列如 SEQ ID NO:25所示。5. 根据权利要求1-4任一项所述双T-DNA载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 载体A的构建：以PCAMBIA1302载体为骨架，设计引物分别通过PCR扩增得到终止子 N0S和T-DNA左边界LB，N0S引入酶切位点Bstell和BamHI，LB引入酶切位点Bglll和SphI，将 扩增得到的N0S和LB分别连到PMD19-T载体上，用酶Bstell和BamHI将N0S片段切下，用酶 Bglll和SphI将LB切下，将得到的酶切两个片段与载体PCAMBIA1302经Bstell和SphI酶切后 回收的大片段，用T4连接酶进行三片段连接，得到含有两个LB边界的载体A; 2) 载体B的构建：设计同源重组特异引物，通过PCR扩增得到两个独立UBI启动子片段， 用酶BamHI和Spel对载体A进行酶切，回收大片段，与上述扩增得到的两个独立UBI启动子片 段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的UBI启动子，且两个背对的UBI之间 含有SaU酶切位点的载体B; 3) 载体C的构建：以pCAMBIA1302载体为骨架，设计引物通过PCR扩增得到两个独立右边 界RB，对载体B进行Sail单酶切，与上述扩增得到的两个独立RB片段采用同源重组的方法进 行连接，得到含有两个背对的RB的载体C; 4) 双T-DNA载体的构建:设计同源重组特异引物扩增⑶S156基因片段和Nos poly-A，分 别回收PCR产物，对载体C进行ΚρηΙ单酶切，利用多片段同源重组将酶切后的载体C与扩增得 到GUS156基因片段和Nos poly-A连接，构建得到双T-DNA载体。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)扩增终止子N0S的引物序列如SEQ ID N0:1和2所示，扩增T-DNA左边界LB的引物序列如SEQ ID N0:3和4所示;扩增得到的终止 子N0S和T-DNA左边界LB序列分别如SEQIDN0:5和6所示。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)扩增两个独立UBI启动子片段的引 物序列分别如SEQ ID N0:7-10所示；扩增得到的两个独立UBI启动子片段分别如SEQ ID NO: 11和12所示。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)扩增两个独立右边界RB的引物序列 分别如SEQ ID NO: 13-16所示；扩增得到的两个独立右边界RB序列分别如SEQ ID NO: 17和 18所示。9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)扩增Nospoly-A的引物序列分别如 SEQ ID NO: 19和20所示，扩增⑶S156基因片段的引物序列分别如SEQ ID NO:21和22所示； 扩增得到的Nospoly-A和GUS156基因片段序列分别如SEQ ID NO:23和24所示。10. 权利要求1-4任一项所述双T-DNA载体在制备无选择标记的转基因植物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其是将报告基因GUS和抗性筛选标记基因串联，将荧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联序列分别连入两个独立的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体上构建得到的。利用该载体培育无选择标记的转基因植物，能快速从后代中检测阳性转基因植株。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84, C12N15/65, C12N15/66
【公开号】CN105505988
【申请号】CN201511002740
【发明人】江千涛, 张晓伟, 杨强, 王际睿, 陈国跃, 祁鹏飞, 刘亚西, 蒲至恩, 李伟, 魏育明, 郑有良
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日