分散于19.2μ1的包含1mM的十二烷基硫酸钠的TE缓冲液后，将珠子分散溶液注入核酸分析用流动池内。在恒温槽内将流路内的珠子悬浊液干燥后，向流路内注入6%丙烯酰胺水溶液而固定珠子。在本实施例中，使用丙烯酰胺来固定珠子，但也可像专利文献5所公开的那样，使用硅烷、聚赖氨酸、生物素与链霉亲和素的结合等进行固定。
[0074](4)核酸分析
[0075]使用专利文献3所公开的核苷酸进行核酸分析。本发明的核酸分析装置设置了固定有前项的珠子的核酸分析用流动池。借助喷嘴915将包含引物的水溶液注入核酸分析用流动池910。使用支撑单元911将核酸分析用流动池910内的水溶液加热至57°C后，保持于4°C。将之前包含核苷酸和DNA聚合酶的水溶液注入后，在60°C保持5分钟进行延伸反应。用缓冲液对核酸分析用流动池910内的流路进行洗涤，去除未反应的核苷酸。利用平台单元912使核酸分析用流动池910移动后，利用检测单元917照射激发光，从而检测处于检测区域内的多个带有核酸试样的珠子所导入的荧光。检测后，注入50mM的叠氮化钠水溶液后，以0.7W/cm2照射波长365nm的UV光4分钟，切断荧光色素。之后，用缓冲液对流动池内进行洗涤。反复进行之前的延伸反应、荧光检测、荧光色素的切断，确定核酸的碱基序列。
[0076]实施例3
[0077]使用专利文献I所公开的模板准备方法代替实施例1的(2)乳液PCR、(3)向核酸分析用流动池固定表面具有DNA的珠子。对形成于基板上的菌落进行测序反应。
[0078](I)文库制作
[0079]与实施例1同样地进行。
[0080](2)向核酸分析用流动池内流路涂覆丙烯酰胺[0081 ]将溶解有lOOmg/ml的BRAPA的DMF溶液 165μ1、TEMED11.5μ1、50mg/ml的过硫酸钾ΙΟΟμΙ与2%丙烯酰胺水溶液1ml混合后，将混合溶液注入流路内。将核酸分析用流动池在室温保持I小时30分钟后，用水对流路内进行洗涤。
[0082](3)引物在丙烯酰胺上的接枝化
[0083]使包含0.5μΜ的正向引物、0.5μΜ的反向引物的水溶液以流量60μ1 /秒向流路内流入75秒后，将核酸分析用流动池在50°C保持I小时。保持后，用5 X SSC缓冲液对流路内进行洗涤。
[0084](4)核酸分析用内流动池内的菌落形成
[0085](5)将由文库制作得到的文库注入核酸分析用流动池内，进行扩增反应而形成菌落。
[0086](6)核酸分析
[0087]按照实施例1的方法，确定核酸的碱基序列。
[0088]实施例4
[0089]向实施例1的叠氮化钠水溶液加入微玻璃珠(品名:EMB-10、Potters-Ballotini株式会社制)。微玻璃珠的平均粒径为5μπι。微玻璃珠可使进入流路内的UV光发生漫反射，从而可进一步提尚切断焚光色素的效率。
[0090]产业上的可利用性
[0091]使用本发明的核酸分析用流动池或核酸分析装置，能够进行各种核酸反应，并且能够进行DNA测序等核酸的分析。
[0092]符号说明
[0093]101、201、301、401、501、601、701(a)、701(b)、701(c)、801:第一基板
[0094]102、202、302、402、502、602、702(&)、702(13)、702(。)、802:滤光片
[0095]103、203、303、403、503、603:中空板
[0096]104、204、304、404、504、604、704(&)、704(13)、704((3)、804:中空部(或流路)
[0097]105、205、305、405、505、605、705(&)、705(13)、705(。):第二基板
[0098]106、206、306、406:注入口
[0099]107、207、307、407:排出口
[0100]408、508、608:近紫外线截止滤光片
[0101]609:反射防止膜
[0102]720:带槽板
[0103]821:附保护膜板
[0104]822:保护膜
[0105]910核酸分析用流动池
[0106]911:支撑单元
[0107]912:平台单元
[0108]913试剂容器
[0109]914送液单元
[0110]915:喷嘴
[0111]916:喷嘴搬送单元
[0112]917:检测单元
[0113]918:废液容器
[0114]919:光源
[0115]1020第一光
[0116]1021:第二光
[0117]1022:第三光
[0118]1023:载体珠
[0119]1024:第四光
【主权项】
1.一种核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。2.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述滤光片透过激发流路内物质的第二光和由流路内物质放射的第三光。3.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述滤光片在第一基板上被图案化成与流路接触。4.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述第二基板具备近紫外线截止滤光片，所述近紫外线截止滤光片透过使流路内物质的化学结构发生变化的第一光，并且反射具有比第一光短的波长的第四光。5.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述第二基板具备防止第一光和第二光反射的反射防止膜。6.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第一光的波长为450nm以下。7.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第一光的波长为320nm以上。8.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第二光的波长为450nm以上。9.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第三光的波长为480nm以上。10.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池， 在第一基板侧具有多个流路槽，进一步，在该流路槽的底面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。11.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池， 在第二基板侧具有多个流路槽，进一步，在与该流路槽相对的第一基板面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。12.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池， 在基板间配置有板， 在板中具有多个流路槽，在这些流路槽的第一基板侧的底面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。13.根据权利要求10?12中任一项所述的核酸分析用流动池，所述滤光片透过激发流路内物质的第二光，还透过由流路内物质放射的第三光。14.一种核酸分析装置，其是分析核酸的核酸分析装置，具备: 核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光； 支撑单元，保持所述核酸分析用流动池； 检测单元，观察所述核酸分析用流动池内的试样； 光源，向所述核酸分析用流动池照射使流路内物质的结构发生变化的第一光； 送液单元，向所述核酸分析用流动池输送试剂。
【专利摘要】本发明提供一种核酸分析用流动池，其是用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池，可在提高光切断反应的反应效率的同时减少荧光检测时的干扰，从而可提高确定序列的正确性，缩短操作时间，使结合碱基长度变长。本发明的核酸分析用流动池贴合有具备滤光片(102)的第一基板(101)、具有用于形成流路的中空部中空板(103)和透过第一光的第二基板(105)，所述滤光片(102)反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。
【IPC分类】G01N21/64, C12Q1/68, C12M1/00, G01N21/05
【公开号】CN105555966
【申请号】CN201480030099
【发明人】奈良原正俊, 庄司智广
【申请人】株式会社日立高新技术
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月11日
【公告号】US20160167049, WO2015015913A1