1H-化挫-5-甲酯胺(化合物I -2)的制备
[0083]
[0084] 化合物1-2可用如下方法制备，具体步骤如下：[0085] 2-(3-滋-1H-邮畔-1 -其）-3,5-二氯邮瞄的制备：
[0095] 2-(3-漠-1-(3，5-二氯化晚-2-基比挫-5-基)-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d] [ 1，
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090] f法进行，由3-漠 -IH
[0091]
[0092]
[0093] 基)-3,5-二氯 化晚3 采用制备2-氨 基-5- :N-舰代下二酷 亚胺韦 1 3]嗯嗦-4-酬(￥-2)的制备：
[0096]
[0097] 向3-漠-1-(3,5-二氯化晚-2-基)-lH-化挫-5-甲酸（I 11-2)(3.4克，IOmmol)和2-氨基-5-氯-3-甲基苯甲酸（IV-2)(1.9克，IOmmol)溶于畑3CN(50mL)中的溶液加入化晚 (5mL)和CH3S02C1 (3mL)，然后揽拌2小时。完成后，将反应混合物浓缩W除去大部分溶剂，并 过滤出黄色固体(2.2克，收率:45%)。3-漠-N-(4-氯-2-甲基-6-(甲基氨基甲酯基)苯基)-1-( 3,5-二氯[I比晚-2-基比挫-5-甲酯胺(化合物1-2)的制备：向2-(3-漠-1-( 3,5-二氯 化晚-2-基)-IH-化挫-5-基)-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d] [ 1，3]嗯嗦-4-酬（III-6) (54毫克， 0.1 Immol)溶于畑3CN( 5mL)中的溶液加入NH20H ? HCl (158.9毫克，2.3mmol)和EtsN (319.311^2.3111111〇1)，在室溫下揽拌1小时。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩且进行快 速层析（二氯甲烧：甲醇=10:1)，得到无色固体（23毫克，收率:40 % ); IH匪R(DMS0-d6， 300MHz)，S:2.30(s，3H)，7.31(s，lH)，7.55(s，lH)，7.65(s，lH)，8.27(s，lH)，8.65(s，lH)， 10.67(s，lH) ;LC-MS:m/z = 517.9181，m/z(计算值）=517.9184。
[009引实施例3:3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-n-(4-氯基-2-巧圣基氨基甲酯基)-6-甲基苯 基)-lH-化挫-5-甲酯胺(化合物1-9)的制备：
[0099]
12 化合物1-9采用与制备实施例1相同的步骤通过上述路线从中间体V-1)制备，其中 的试剂化合物VI)用畑20H ?肥1来代替C曲ON此? HC1。向2-(3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-lH-化挫-5-基)-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d] [ 1，3]嗯嗦-6-甲腊(V-1) (50毫克，0.1 Immol)溶于 CH3CN( 5mL)中的溶液加入畑2地?肥1 (159.8毫克，2.3mmo 1)和化3N( 319.3uL，2.3mmo 1)，在 室溫下揽拌I小时。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩且进行快速层析(二氯甲烧：甲醇 = 10:l)，得到为无色固体（15毫克，收率:28%);lHNMR(DMS0-d6,300MHz)，S:2.14(s，3H)， 7.36(s，lH)，7.61-7.65(dd，lH，J = 7.8Hz，J = 4.細z)，7.75(s，lH)，8.04(s，lH)，8.18-8.21 (d，lH，J = 7.8Hz) ,8.51-8.52 (d，lH，J = 4. SHz ),10.33-10.37 (brs，2H); LC-MS :m/z = 474.9907，m/z(计算值）=474.9916。 2 实施例4: 3-漠 -1-(3-氯化晚-2-基)N-(4-氯-2-(乙氧基氨基甲酯基)-6-甲基苯 基)-lH-化挫-5-甲酯胺(化合物1-6)的制备：
[0102]
[0103] 施例I相同的步骤合成，其中的试剂化合物IV用IV-2代替 IV-I 得 4
[0104]
[0105] 2-(3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-lH-化挫-5-基)-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d][l，3] 嗯嗦-6-甲腊V-3的制备：向3-漠-1-(3-氯[I比晚-2-基比挫-5-簇酸(3.2克，0.0 lmol)和 2-氨基-5-氯基-3-甲基苯甲酸（1.9克，0.0 lmol)溶于C册CN(SOmL)中的溶液加入化晚（5血） 和CH3S02Cl(3mL)，然后揽拌2小时。完成后，将反应混合物浓缩W除去大部分溶剂，并过滤 出黄色固体(1.9克，收率:40% )。用制备实施例1相同的步骤，将中间体V-3转化成产物1-6， 其中的试剂化合物VI用C册C肥0NH2 ? HCl代替CH30N肥? HCl来制备1-6。向2-(3-漠-1-(3-氯化晚-2-基）-lH-化挫-5-基）-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d][l，3]嗯嗦-4-酬V-3(52毫克， 0.1 Immol)溶于CH3CN( 5mL)中的溶液加入CH3CH20NH2 ? HCl (225毫克，2.3mmol)和Et3N (319.311^2.3111111〇1)，在室溫下揽拌1小时。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩且进行快 速层析（二氯甲烧：甲醇= 10:1)，得到无色固体（22毫克，收率：38%); IH匪R(DMS0-d6， 300MHz)，S:1.24(t，3H)，2.23(s，3H)，3.53(q，2H)，7.30(s，lH)，7.52(s，lH)，7.61(dd，lH，J = 8.0Hz，J = 4.8Hz)，7.70(s，lH)，8.17(d，lH，J = 8.0Hz)，8.49(d，lH，J = 4.8Hz)，10.45(s， IH) ;LC-MS:m/z = 511.9880，m/z(计算值）=511.9887。
[0106] 实施例5:3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-N-(4-氯基-2-(乙氧基氨基甲酯基)-6-甲基 苯基)-IH-化挫-5-甲酯胺(化合物I-11)的制备：
[0107]
[010引向2-(3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-lH-化挫-5-基）-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d] [1，3]嗯嗦-6-甲腊(V-l)(30毫克，0.07mmol)和ミ乙胺（143毫克，1.4mmol)溶于3毫升C册CN 中的溶液加入CH3CH20NH2 ? HCl (138毫克，1.4mmol)，在室溫下揽拌过夜。将反应混合物过 滤，并将滤液真空浓缩且进行快速柱层析(二氯甲烧：甲醇= 10:1)，得到白色固体(6毫克， 收率：18%);lHNMR(DMS0-d6,300MHz)，S:1.21(t，3H)，2.22(s，3H)，3.91(q，2H)，7.40(s， lH)，7.63(dd，lH，J = 7.9Hz，J = 4.細z)，7.75(s，lH)，7.91(s，lH)，8.18(d，lH，J = 7.9Hz)， 8.48(d，lH，J = 4.8Hz)，10.48(s，lH)，11.45(s，lH);LC-MS:m/z = 503.0225，m/z(计算值）= 503.0229。
[0109] 实施例6:3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-N-(4-氯-2-(甲氧基氨基甲酯基)-6-甲基苯 基)-1H-邮挫-5-甲醜胺(化合物I -5)的制备：
[0110]
[0111] 运个化合物采用与制备实施例1相同的步骤合成，用CH30NH2 ? HCl与将中间体V-3)反应，将其转化成广物（1-5)。向2-(3-漠-1-(3-氯R比晚-2-基)-lH-R比挫-5-基)-6-氯-8-甲基-4H-苯并[d] [ 1，3]嗯嗦-4-酬(V-3) (49.7毫克，0.1 Immol)溶于C册CN巧血）中的溶液加 入C册ON肥?肥1 (192.1毫克，2.3mmol)和化3N(319.3uL，2.3mmol)，在室溫下揽拌1小时。将 反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩且进行快速层析(二氯甲烧：甲醇= 10:1)，得到无色固 体（23毫克，收率：40 % ); lHNMR(DMS0-d6，300MHz)，S : 2.22( S，3H)，3.45( S，3H)，7.32(S， lH)，7.51(s，lH)，7.61(dd，lH，J = 7.8Hz，J = 4.8Hz)，7.69(s，lH)，8.19(d，lH，J = 7.細z)， 8.49(d，lH，J = 4.8Hz )，10.87(s，l);LC-MS:m/z = 497.9721，m/z(计算值）=497.9730。表 1 列出了制备通式(I)化合物I-I到1-18的具体结构:表中r1，R2，R3与上述通式(I)中已经定义 的Ri ,R2 ,R3有相同的含义。
[0112] 实施例7:3-漠-1-( 3-氯[I比晚-2-基)-N-(4-氛基-2-(异丙氧基氨基甲酯基)-6-甲 基苯基)-lH-化挫-5,甲酯胺（1-27)的制备
[0113]
[0114]
[0115] 123 2-氨基-5-氯基-N-异丙氧基-3-甲基苯甲酯胺VIII-I的制备：向2-氨基-5-氯基- 2 3-甲基苯甲酸1￥-1(200毫克，1.14111111〇1)和0-异丙基径氨（127毫克，1.14111111〇1)溶于10毫升 3 二氯甲烧的混合溶液中加2-(7-偶氮苯并S氮挫)-N，N，N/，N/-四甲基脈六氣憐酸醋(HATU) (649毫克，1.71mmol)和N，N-二异丙基乙胺(01?64)(441毫克，3.42臟〇1)，室溫下揽拌过夜。 将溶剂真空抽干，将剩余固体用硅胶柱分离(石油酸/乙酸= 3/1)纯化得到黄色油状产物 (120毫克，收率42%)。3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-N-(4-氯基-2-(异丙氧基氨基甲酯基)-6-甲基苯基)-lH-化挫-5-甲酯胺（1-27)的制备：向3-漠-1-(3-氯-化晚基)-lH-化挫-5-甲酸 111-I (50毫克，0. 17mmol)溶于10毫升二氯甲烧的溶液中滴入乙二酷氯（63毫克， 0.495mmol)和一滴DMF，室溫下揽拌2小时，将溶剂真空抽干得到酷氯中间体3-漠-1-(3-氯 化晚-2-基)-lH-化挫-5-甲酯氯IX-I。将中间体IX-I溶于1毫升化晚，加2-氨基-5-氯基-N-异丙氧基-3-甲基苯甲酯胺VIII-1(41毫克，0.17mmol)，加热到60°C，保持30分钟，加10毫升 水混合，用乙酸乙醋萃取3次，每次10毫升，加10毫升盐水，用硫酸钟干燥，浓缩，用制备薄层 色谱分离提纯得到白色固体产物（15毫克，17 % )。IH匪R(DMS0-d6，300MHz)，S : 1.25(d， 6H)，3.95(m，lH)，7.40(s，lH)，7.60(dd，lH，J = 7.8Hz，J = 4.7Hz)，7.72(s，lH)，7.90(s， lH)，8.16(d，lH，J = 7.細z)，8.45(d，lH，J = 4.7Hz)，10.39(s，lH)，11.45(s，lH);LC-MS:m/z = 517.0386，m/z(计算值）=517.0385。
[0117]实施例8:3-漠-N-(2-(叔下氧基氨基甲酯基)-4-氯-6-甲基苯基)-1-(3-氯化晚-2-基)-lH-化挫-5-甲酯胺1-20的制备：
[011 引
[0119] 化合物1-20采用与制备实施例7相同的步骤制备，其中0-异丙基径氨用0-叔下基 径氨代替，2-氨基-5-氯基-3-甲基苯甲酸IV-I用2-氨基-5-氯-3-甲基苯甲酸IV-2代替，得 到产物I-20。lH醒R(DMS0-d6,300MHz)S:1.15(s，9H)，2.21(s，3H)，7.32(s，lH)，7.52(s， lH)，7.60(dd，lH J = 7.8Hz J = 4.8Hz)，7.66(s，lH)，8.17(d，lH，J = 7.Wz)，8.50(d，lHJ =4.細 z)，10.53(s，lH);LC-MS:m/z = 540.0185，m/z(计算值）=540.0200。
[0120] 实施例9:3-漠-N-(2-(叔下氧基氨基甲酯基）-4-氯基-6-甲基苯基）-1-(3-氯化 晚-2-基)-lH-化挫-5-甲酯胺1-28的制备：
[0121]
12 化合物1-28采用与制备实施例7相同的步骤制备，其中0-异丙基径氨用0-叔下基 径氨代替，得到产物 1-28。IH NMR(DMS0-d6，300MHz) S: 1.22 (S，9H)，2.22(S，3H)，7.38(S， lH)，7.58(dd，lH，J = 7.8Hz，J = 4.細z)，7.69(s，lH)，7.86(s，lH)，8.11(d，lH，J = 7.細z)， 8.40(d，lH，J = 4.8Hz)，10.43(s，lH)，11.55(s，lH);LC-MS:m/z = 531.0538，m/z(计算值）= 531.0542。 2 实施例10:3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-N-(4-氯基-2-( ((1，1-二氧-四氨-2H-嚷喃- 4-基)氨基甲酯基)6-甲基苯基)-lH-化挫-5-甲酯胺1-32的制备：
[0124]
[0125] 化合物1-32采用与制备实施例7相同的步骤制备，其中0-异丙基径氨用4-(氨基氧 基）四氨-2H-嚷喃-1，1-二氧化物代替得产物 1-32。lHNMR(DMS0-d6，300MHz)，S: 1.35-1.48 (m，4H)，1.75-1.81(m，4H)，2.24(s，3H)，3.61(m，lH)，7.41(s，lH)，7.60(dd，lH，J = 7.細z，J = 4.5Hz)，7.78(s，lH)，7.89(s，lH)，8.17(d，lH，J = 7.細z)，8.47(d，lH，J = 4.5Hz)，10.65 (S，1H) ;LC-MS:m/z = 607.0151，m/z(计算值）=607.0161。
[01 %] 实施例n : 3-漠-1-(3-氯化晚-2-基)-N-(4-氯-2-甲基-6-( ((I-甲基-I-氧化麟杂 环己烧-4-基)氧基)氨基甲醜基)苯基)-1H-化挫-5-甲酯胺I -23的制备：
[0127]
[0128] 化合物1-23采用与制备实施例8相同的步骤制备，其中0-叔下基径氨用4-(氨基氧 基）四氨-2H-嚷喃-1，1-二氧化物代替，得到产物（1-23)。IH匪R(DMS0-d6，300MHz)，S : 1.34-1.48(m，4H)，1.76-1.83(m，4H)，2.22(s，3H)，3.62(m，lH)，7.38(s，lH)，7.60(m，2H)， 7.55(s，lH)，7.62,8.17(d，lH，J = 8.1Hz)，8.49(d，lH，J = 4.5Hz)，10.10(s，lH);LC-MS:m/z = 615.9810，m/z(计算值）=615.9819。表1列出了用上述制备的通式化合物I的1-19到1-32 的具体结构。表中r1、r 2、r3与上述通式(I)中已经定义的r1、r2、r3有相同的含义。
[0129] 实施例12:昆虫鱼尼下受体基因的克隆：
[0130] 将来自烟芽夜蛾（Heliothis virescens)和黑腹果蛹（Drosophila melanogaster)的昆虫鱼尼下受体基因克隆到sf9细胞系中，使得能对化合物生物活性进行 测试，W获得关于其基于下文所描述的鱼尼下受体(RYR)激动剂活性的杀虫能力的信息。黑 腹果蛹基因序列来自：http://www.ncbi .nlm.nih.gov/p;rotein/Q24498.3,RecNameJull = Ryanodine receptor44F，SwiSS-Prot :Q24498.3(residuesIto5127)，参见：Takeshima， H.,Nishi，M.，Iwabe，N.,Miyata，T.,Hosoya，T,Masai，I. and Hotta，Y. Isolation and ch曰r曰cteriz曰tion of 曰 gene for 曰 ryanodine recepto r/c曰Icium release channel in Droso曲ila melanogaster,F邸S Lett.337(1) :81_87(1994)。烟芽夜蛾基因序列来自： http：// WWW.ncbi.nlm.nih.gov/protein/294518427,GenBank：ADE98194. I , Residueslto5128nDNA序列用下列方法优化W提高蛋白表达程度:通过提高CAI值到0.88增 加密码子使用偏好性，优化GC含量和不利峰W增力化RNA的稳定性，将茎环结构打碎W增加 mRNA的稳定性和与核糖体结合力，筛选改变了一些负顺式作用位点。将DNA放到PU巧7质粒 载体里。用pIB/V5-His质粒载体（Invitrogen)作亚克隆，克隆位点为BamHI-XhoI ,Qiagen去 内毒素质粒抽提试剂盒，TE缓冲液（IOmM Tri S-Cl，P册.O，ImM邸TA),采用Qiagen大提质 粒的步骤化ttp://invitrogen.com)。克隆的黑腹果蛹基因 DNA的长度为15398碱基对，烟芽 夜蛾基因 DNA的长度为15401碱基对。克隆基因方法的参考文献：C.L. Patten，et al. (2009).Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA.Washington,D.C：ASM Press.ISBNl-55581-498-0；BrownT.(2006).Gene cion