一种药用二萜化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及从裸花紫珠的干燥地上部分中分离得到的一 种二祗类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 裸花紫珠化Ilicarpa nudiflora Hook.et Arn.为马鞭草科紫珠属植物，生于平 地至海拔1200m的山坡、路旁、谷地、溪边或灌木林丛中，在年平均溫度15~25°C、湿度较大 的环境生长良好，国内主要分布于广东、广西、海南等地，在海南产于定安、僱州、澄迈、白 沙、昌江、东方、=亚、陵水、保亭、琼中等地，其中W海南五指山的为上品；国外主要分布于 印度、中南半岛、马来半岛及新加坡等。
[0003] 裸花紫珠药用部位为地上干燥部分，是一种海南大宗性地道药材，同时也是海南 黎族医生常用药材之一。裸花紫珠全年均可采收，除去杂质，晒干，枝叶有抗菌止血、消炎解 毒、散疲消肿、驱风桂湿之功效，主治化脈性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、 创伤出血等症，外用治烧、烫伤及外伤出血等。
[0004] 近年来，国内外对裸花紫珠化学成分的研究报道较少，从中分离的成分主要有黄 酬类、祗类、挥发油和酪类等。裸花紫珠中黄酬类化合物主要有木犀草素及其配糖体。裸花 紫珠所含祗类化合物主要有:环締酸祗类化合物，二祗类化合物和=祗类化合物等。
[0005] 裸花紫珠的药理活性有止血、抗炎、抑菌、细胞毒活性、增强免疫等。我国医药市场 上有裸花紫珠片、裸花紫珠栓剂等制剂，在皮肤科、妇科炎症的治疗和术后止血等方面具有 较好的治疗效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从裸花紫珠的干燥地上部分中分离得到的一种二祗类 化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[000引一釉親田^祀化会物I.々且右下冰结均式的化合物（I):
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制备方法，包含W下操作步骤：（a)将裸花紫珠的干燥地上部 分粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋 和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步 骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙醇洗 脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中70 %乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和 2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得至Ij3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为75%。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] 本发明化合物用作药物时，可W直接使用，或者W药物组合物的形式使用。直接使 用时，化合物（I)通过抑制细胞增殖及诱导细胞调亡发挥对人脑恶性胶质母细胞瘤U251细 胞的抑制作用。W药物组合物的形式使用时，该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合 物（I)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。所述 的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料W及药物制品 辅剂。将本发明的药物组合物W单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注 射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴 丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶 液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。研究表明，化合物（I)作为有效成分制备的药物组合物副作 用将大大减小，而且在治疗胶质瘤的临床药物提供一种新的选择。
【附图说明】
[0014] 图1为化合物(I)结构式；
[0015] 图2为化合物（I)计算ECD和实验ECD图；
[0016] 图3为化合物（I)处理后U251细胞桐调亡率的变化。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0018] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0019] 乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[002。 （a)裸花紫珠的干燥地上部分（IOkg)粉碎，用75 %乙醇热回流提取侦L X 3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水饱和的正 下醇(化X3次)萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(377g)和正下醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用70% 乙醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物（129g); (C)步骤 (b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1(8个柱体积）、20:1(8个 柱体积）、10:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤（C)中组分4(24g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积）、5:1 (10个柱体积)和2:1(8个柱体积)的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组 分2 (15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度 洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (42mg)。
[0022] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 449.1608,结合核磁特征可得分子式为 C2姐26〇7，不饱和度为 12。核磁共振氨谱数据Sh(邮m，DMSO-ds，600MHz): H-I (5.58，S)，H-3 (2.18，m)，H-3(1.96，m)，H-6C.47，d，J = 6.0)，H-7(5.12，d，J = 6.0)，H-ll(6.92，s)，H-15 (6.74，d，J = 2.4)，H-16(7.58，d，J = 2.4)，H-17(2.45，s)，H-18(l.ll，s)，H-19(l.ll，s)，H-20(1.47，s)，l-OCOC曲（1.91，S)，6-OCOC曲（2.14，S);核磁共振碳谱数据Sc(ppm，DMSO-ds， 125MHz):91.7(CH，1-C)，201.3(C，2-C)，43.7(CH2,3-C)，30.1(C，4-C)，99.7(C，5-C),81.2 (CH，6-C)，79.6(CH，7-C)，128.6(C，8-C)，140.1(C，9-C)，46.4(C，10-C)，104.2(CH，11-C)， 155.3(C，12-C)，131.0(C，13-C)，131.9(C，14-C)，105.8(CH，15-C)，145.8(CH，16-C),16.8 (CH3，17-C)，29.3(CH3，18-C)，24.2(C出，19-C) ,29.1 (CH3,20-C)，171.1 (C，1-0C0CH3) ,20.7 (C出，I-OCOC曲），172.8 (C，6-OCOC出），21.9 (C出，6-OCOC出）；碳原子标记参见图I。红外光谱 表明该化合物含有芳香碳(3012皿和1613皿）</H NMR谱显示4个甲基信号姐1.1UH-18和H-19)，1.47化-20)，2.45巧-17)。两个相互禪合的締控质子信号如6.74化-15，(1^ = 2.4)和 7.58化-16，d，J = 2.4Hz)表明该化合物含有一个稠合巧喃环。I3C NMR显示24个碳信号，其中 包括6个芳香族碳信号SC104.2,128.6,131.0,131.9,140.1和155.3。运些数据表明，该化合 物为与巧喃环稠合的二祗类化合物。HMBC谱中，H-Il (化6.92，s)与C-12(SC155.3)和C-13(S 0131.0);曲-17(如2.45,3)与(：-8(5(：128.6)，(：-13(5(：131.0)，(：-14(5(：131.9)和(：-15(5 C105.8)的相关性验证了苯环与巧喃环共辆运一推论。此外，C-I (SC91.7)和C-6(SC81.2)与 相应的乙酷氧基（SC171.1，姐1.91和SC172.8,姐2.14)的相关性表明C-I和C-6位各连有一 个乙酷氧基。歷BC谱中H-7和C-5的相关性说明该化合物含有氧杂环下烧部分。NOESY谱中， H-I和H-6与出-20的相关性表明H-I和H-6为0-构型。综合氨谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，W 及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD 试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0023] 实施例2:化合物(I)药理作用试验
[0024] 一、材料和仪器
[0025] 本实验采用人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞株，购自美国模式菌种收集中屯、。 DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司;氯化钢、氨氧化钢、氯化钟、氯化氧、氨氧化钢、憐酸 氨二钢、憐酸二氨钢、憐酸二氨钟、甲醇购自南京化工厂。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度 大于98%。甘氨酸、T;ris、Tween20、二甲基亚讽(DMEM)购自美国Sigma公司;Aimexin-V/PI细 胞调亡试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞裂解液、0.25 %膜蛋白酶、Cell Counting Kit-8试剂盒、青霉素、链霉素、Hoechs口3258、细胞核染料DAPI、PMSF、Western blot凝胶配 制试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒、考马斯亮蓝染色液、标准蛋白、5X蛋白质变性缓冲液盒、 E化超敏发光液、显影定影试剂盒、X线胶片、硝酸纤维素膜、抗巧光泽灭封片液购自江苏碧 云天生物研巧所。胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗体购自美国NOVUS 公司；兔抗人化StonH3抗体购自美国CST公司；山羊抗兔皿P二抗购自美国SantaCruz公司； 山羊抗兔巧光二抗购自美国公司。
[0026] -20°C低溫冰箱(海尔青岛），-80°C低溫冰箱(海尔青岛），低溫冰箱(海尔青岛），高 速离屯、机（飞鹤上海），培养皿/板(Coming美国），离屯、管(Coming美国），细胞培养箱(Thermo 美国），倒置显微镜(Olympus日本），巧光倒置相差显微镜(ZEISS德国），多用途恒溫水浴箱 (跃进上海），电子天平仪(上海机密科学仪器），超净工作台（ARITECH日本），微量移液器 (Dragon芬兰），酶标仪(Bio-RAD德国），流式细胞仪(BDAc州riC6美国）。
[0027] 二