一种羟脯氨酸发酵生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明属于氨基酸的分离提取技术领域，具体涉及一种羟脯氨酸发酵生产工艺，本发明采取多级串联膜分离技术与电渗析技术，创造了一项特有的自发酵液分离羟脯氨酸技术，形成了一条全新的羟脯氨酸发酵生产工艺，按照本发明进行操作，可实现羟脯氨酸发酵法生产过程的废渣废水零排放，彻底根除羟脯氨酸发酵法生产过程中的环境污染问题，并且可将羟脯氨酸的总收率提高至70％以上，羟脯氨酸产品的质量也大为提高，含量可达到99％以上。
【专利说明】
一种羟脯氨酸发酵生产工艺
技术领域
[0001]本发明涉及一种氨基酸的分离提取技术领域，尤其涉及一种羟脯氨酸发酵生产工
-H-
O
【背景技术】
[0002]轻脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸轻基化后的产物，其分子式为C5H9NO3t3羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274°C，易溶于水，微溶于乙醇。根据羟脯氨酸羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。因羟脯氨酸有两个不对称碳原子，所以有4种立体异构体，自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。
[0003]反式-4-轻脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
[0004]目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4%-7 %，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。
[0005]自发酵液中分离提取羟脯氨酸，通常采用离子交换方法，将除去菌体的发酵液在特定的PH条件下上柱，让羟脯氨酸吸附在离子交换柱上，随后用去离子水对离子交换柱充分洗涤，除去杂质，然后用洗脱液将羟脯氨酸从离子交换柱上洗脱，得到羟脯氨酸溶液，再经过结晶和干燥，得到羟脯氨酸产品。该方法存在以下缺陷:①羟脯氨酸易氧化，收率不稳定;②粗羟脯氨酸杂质多、色泽深，影响精制收率及产品质量。③耗水量大，酸碱用量大，在生产过程中会产生大量的废渣和废水，对环境造成非常严重的污染。能够克服这些缺陷，使羟脯氨酸的发酵法生产以一种环境友好的方式进行，实现提取生产过程的废渣废水零排放，彻底根除生产过程中环境污染问题的发酵生产工艺国内外尚未见任何报道。
【发明内容】
[0006]本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种羟脯氨酸发酵生产工艺，此工艺既能保证羟脯氨酸的得率和品质，又能够实现废渣废水零排放，将多级串联膜分离技术与电渗析技术有机组合起来，形成了一条羟脯氨酸发酵生产工艺。
[0007]本发明为实现上述目的，采用以下技术方案:一种羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，包括以下操作步骤:
[0008](I)、菌体分离:对含有羟脯氨酸的发酵液进行分离，得到除去菌体的羟脯氨酸原液和菌渣；
[0009](2)、初级膜分离:对所得到的羟脯氨酸原液进行初级膜分离，将羟脯氨酸原液分为浓缩液和透过液两个部分；
[0010](3)、浓缩液处理:所得到的浓缩液，与菌渣合并，然后进行干燥，得到固体粉末，gp为生物发酵饲料；
[0011 ] (4)、电渗析浓缩:对所得到的透过液进行电渗析浓缩，将透过液分为电渗析浓缩液和电渗析稀液两个部分；
[0012](5)、结晶:所得到的电渗析浓缩液进行结晶，然后将结晶与母液分离、干燥，得到羟脯氨酸粗结晶固体；
[0013](6)、母液处理:所得到的母液可以与电渗析浓缩液合并，循环套用；亦可并入浓缩液，制备生物发酵饲料；
[0014](7)、次级膜分离:对所得到的电渗析稀液进行次级膜分离，将电渗析稀液分为次级浓缩液和次级透过液两部分；
[0015](8)、电渗析浓缩:所得到的次级浓缩液并入透过液，去进行电渗析浓缩；
[0016](9)、次级透过液处理:所得到的次级透过液，作为工艺用水循环套用，用于羟脯氨酸的发酵生产。
[0017]所述步骤(I)中菌体分离应当在pH:2.0?7.5，温度为5?95 V的条件下进行，优选的为20?60°C，菌体分离的方式为过滤分离、离心分离中的一种或结合。
[0018]所述步骤(2)中初级膜分离应当在pH:2.0?7.5，温度为5?95°C的条件下进行，优选为20?60 °C;所采用的膜应当为截留分子量为195?3%Da的纳滤膜，膜材料为陶瓷、聚醋酸纤维、聚砜、聚四氟乙烯中的一种;膜组件的构型为管式膜、卷式膜、平板膜、中空纤维膜中的一种。
[0019]所述步骤(4)中电渗析浓缩应当在pH:2.0?9.0，温度为5?95°C的条件下进行，优选为20?60°C。
[0020]所述步骤(5)中结晶应当在pH:5.78?5.81，温度为O?10 °C的条件下进行，优选为O?5°C ;结晶与母液的分离方式为过滤、离心、抽滤中的一种;菌渣和结晶的干燥方式为气流干燥、滚筒干燥、真空干燥中的一种。
[0021 ]所述步骤(7)中次级膜分离应当在pH: 2.0?9.0，温度为5?95°C的条件下进行，优选为20?60°C;所采用的膜为反渗透膜，膜组件的构型为管式膜、卷式膜、平板膜、中空纤维膜中的一种。
[0022]本发明的有益效果是:按照本发明的工艺进行操作，可实现羟脯氨酸发酵法生产过程的废渣废水零排放，彻底根除羟脯氨酸发酵法生产过程中的环境污染问题，并且可将羟脯氨酸的收率提高至70%以上，羟脯氨酸产品的质量也大为提高，含量达到99%以上。具体有益效果如下:
[0023](1)、电渗析浓缩过程中所产生的稀液可以经反渗透膜处理，对其中所含有的固形物进行彻底的截留，稀液可被浓缩10倍以上，其中的固形物含量达到4%以上，而不会造成膜的堵塞，并且透过液的品质可达到作为工艺用水供发酵生产循环使用的要求，由此可彻底消除羟脯氨酸加工生产过程所产生的工艺废水。
[0024](2)、除去菌体后的羟脯氨酸原液可以经纳滤处理，对其中所含有的胶体、蛋白、色素等大分子有机物质，以及还原糖类和硫酸根离子、钙离子、镁离子等二价离子进行彻底的截留，羟脯氨酸原液可被浓缩20倍以上，其中的固形物含量达到10%以上，而不会造成膜的堵塞，得到品质极佳的可供电渗析浓缩之用的透过液。并且经过浓缩的原液和菌渣以及羟脯氨酸结晶母液含有大量的蛋白质、氨基酸和糖类、矿物质等营养成分，经过适当的加工处理，可以做成生物发酵饲料销售，提高了原料及中间产物的利用率。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步说明:
[0026]实施例1
[0027]羟脯氨酸含量4.58%，？!16.5，残糖0.8%，NH4+0.5mol/L的羟脯氨酸发酵液300L，在45°C下，用220nm聚醋酸纤维微孔滤膜过滤，得到羟脯氨酸含量4.58%的滤液2981滤渣2.0kg;滤液在相同的温度和pH条件下用截留分子量为300Da的纳滤膜浓缩，得到固形物含量为10 %的浓缩液13L和羟脯氨酸含量4.58 %的透过液285L;将透过液在相同的pH，55 °C下用电渗析浓缩，得到含羟脯氨酸9.1 %，N H 4 +1 m ο I / L的电渗析浓缩液14 2 L和含羟脯氨酸
0.2%，NH4+0.05mol/L的电渗析稀液141L，电渗析稀液用卷式反渗透膜装置进行浓缩处理，得到含羟脯氨酸2 %，NH4+0.5mo I /L的反渗透浓缩液14L和反渗透透过液127L。将电渗析浓缩液的PH调至5.8，在30min内冷却至4°C，然后保温静置过夜，让羟脯氨酸晶体析出，经真空抽滤，真空干燥，得到羟脯氨酸固体11.4kg;经HPLC检验，其羟脯氨酸含量达到99 % ；结晶母液并入浓缩液和菌渣，经气流干燥，得到可作为饲料的固体18.2kg;反渗透浓缩液并入透过液，去进行电渗析浓缩;反渗透透过液作为工艺用水供发酵生产，然后得到发酵液，重复上述工艺，得到大致相同的结果。
[0028]实施例2
[0029]羟脯氨酸含量4.29 %、pH6.6，残糖0.8 %，順4+0.5mol/L的羟脯氨酸发酵液500L，在45°C下，用10nm聚醋酸纤维微孔滤膜过滤，得到羟脯氨酸含量4.29%的滤液497L，滤渣
3.1kg;滤液在相同的温度和pH条件下用截留分子量为300Da的卷式纳滤膜浓缩，得到固形物含量为12%的浓缩液21L和羟脯氨酸含量4.29 %的透过液476L;将透过液的pH值调至5.79，然后在60°C下用电渗析与卷式反渗透膜组合装置进行脱盐、浓缩处理，得到羟脯氨酸含量7.09 %的反渗透浓缩液284L;将反渗透浓缩液在30min内冷却至4 °C，然后保温静置过夜，让羟脯氨酸晶体析出，经离心，收集晶体，真空干燥，得到羟脯氨酸固体18.3kg;经HPLC检验，其羟脯氨酸含量达到99 %。
[0030]实施例3
[0031]羟脯氨酸含量4.29%，pH6.6，残糖0.8%，NH4+0.5mol/L的羟脯氨酸发酵液500L，在45 0C下经15000rpm高速离心，得到羟脯氨酸含量4.29 %的上清液497L，滤渣3.0kg;上清液在相同的温度和PH条件下用截留分子量为290Da的纳滤膜浓缩，得到固形物含量为10%的浓缩液21L和羟脯氨酸含量4.29%的透过液4751^;将透过液在相同的?!1、55°(:下用电渗析浓缩，得到含羟脯氨酸8.3%，NH4+lmol/L的电渗析浓缩液238L和含羟脯氨酸0.2%，NH4+
0.05mol/L的电渗析稀液237L，电渗析稀液用卷式反渗透膜装置进行浓缩处理，得到含羟脯氨酸2 %，ΝΗ/0.5moI/L的反渗透浓缩液24L和反渗透透过液213L;将电渗析浓缩液的pH调至5.8，在30min内冷却至4°C，然后保温静置过夜，让羟脯氨酸晶体析出，经真空抽滤，真空干燥，得到羟脯氨酸固体19.6kg;经HPLC检验，其羟脯氨酸含量达到99 % ；结晶母液与电渗析浓缩液合并，循环套用;浓缩液和菌渣，经气流干燥，得到生物发酵饲料3.4kg;反渗透浓缩液并入透过液，去进行电渗析浓缩;反渗透透过液作为工艺用水供发酵生产，得到发酵液，重复上述工艺，得到大致相同的结果。
[0032]上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，包括以下操作步骤: (1)、菌体分离:对含有羟脯氨酸的发酵液进行分离，得到除去菌体的羟脯氨酸原液和菌渣； (2)、初级膜分离:对所得到的羟脯氨酸原液进行初级膜分离，将羟脯氨酸原液分为浓缩液和透过液两个部分； (3)、浓缩液处理:所得到的浓缩液，与菌渣合并，然后进行干燥，得到固体粉末，即为生物发酵饲料； (4)、电渗析浓缩:对所得到的透过液进行电渗析浓缩，将透过液分为电渗析浓缩液和电渗析稀液两个部分； (5)、结晶:所得到的电渗析浓缩液进行结晶，然后将结晶与母液分离、干燥，得到羟脯氨酸粗结晶固体； (6)、母液处理:所得到的母液可以与电渗析浓缩液合并，循环套用；亦可并入浓缩液，制备生物发酵饲料； (7)、次级膜分离:对所得到的电渗析稀液进行次级膜分离，将电渗析稀液分为次级浓缩液和次级透过液两部分； (8)、电渗析浓缩:所得到的次级浓缩液并入透过液，去进行电渗析浓缩； (9)、次级透过液处理:所得到的次级透过液，作为工艺用水循环套用，用于羟脯氨酸的发酵生产。2.根据权利要求1所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(I)中菌体分离应当在pH: 2.0?7.5，温度为5?95 °C的条件下进行，菌体分离的方式为过滤分离、离心分离中的一种或结合。3.根据权利要求1或2所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，步骤(I)中菌体分离的温度为20?60 °C。4.根据权利要求1所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中初级膜分离应当在pH:2.0?7.5，温度为5?95°C的条件下进行，所采用的膜应当为截留分子量为195?395Da的纳滤膜，膜材料为陶瓷、聚醋酸纤维、聚砜、聚四氟乙烯中的一种;膜组件的构型为管式膜、卷式膜、平板膜、中空纤维膜中的一种。5.根据权利要求1或4所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中初级膜分离的温度为20?60°C。6.根据权利要求1所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(4)中电渗析浓缩应当在pH: 2.0?9.0，温度为5?95°C的条件下进行。7.根据根据权利要求1或6所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(4)中电渗析浓缩温度为20?60°C。8.根据权利要求1所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(5)中结晶应当在pH: 5.78?5.81，温度为O?10°C的条件下进行，结晶与母液的分离方式为过滤、离心、抽滤中的一种;菌渣和结晶的干燥方式为气流干燥、滚筒干燥、真空干燥中的一种。9.根据权利要求1或8所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(5)中结晶的温度为O?5 °C。10.根据权利要求1所述的羟脯氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述步骤(7)中次级膜分离应当在pH:2.0?9.0，温度为5?95°C的条件下进行;所采用的膜为反渗透膜，膜组件的构型为管式膜、卷式膜、平板膜、中空纤维膜中的一种。
【文档编号】A23K20/142GK105837488SQ201610204228
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】赵体金, 林俊辉, 彭久合
【申请人】天津市敬业精细化工有限公司