一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用
【专利摘要】本发明公开一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体由靶序列和与靶序列经过IRES序列连接的阻断免疫检测点的scFv序列组成；其中，所述靶序列由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。本发明利用阻断免疫检测点和嵌合抗原受体疗法的特性集中于一体，联合阻断免疫检测点和特异肿瘤靶向技术，得到一种改造的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体。该阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外大规模扩增之后回输到患者体内，经过改造的T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤靶向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
【专利说明】
一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及嵌合抗原受体领域，尤其涉及一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。目前，传统手术、化疗、放疗是全球肿瘤治疗的三大主要治疗手段。其中传统手术切除是肿瘤行业中最基本、最重要的肿瘤治疗手段，大部分早期发现的癌症，均可以通过传统手术切除达到治愈的目的。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖的一种治疗方式，其应用面很广，特别对于化疗敏感型肿瘤的治疗效果较好，但对大多数肿瘤的治疗的有效性较低，特别对中晚期肿瘤患者，治疗效果有限，并且化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫细胞一同杀灭，导致病患者免疫能力和身体机能下降，生活质量降低。放疗是用放射线照射癌组织，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，是大多数肿瘤的辅助疗法，然而由于放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，多次放疗后，患者会产生一系列毒副作用和反应，对中晚期肿瘤患者，放疗作用有限。
[0003]肿瘤生物治疗是近年来一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗新型方法。肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域最具前景研究方向之一，各大药企纷纷寻求与其他公司合作研发肿瘤免疫相关治疗方法。初步的临床试验结果表明其治疗效率非常高，Science杂志也将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。其主要是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，具有极其光明的应用前景。
[0004]随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。目前，免疫肿瘤疗法最热门、最有效果的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor T cells, CART)疗法以及免疫检查点的单克隆抗体疗法。免疫检查点控制共刺激和共抑制信号的平衡，而共刺激和共抑制信号在维持自身耐受和调节T细胞应答的幅值与持续时间方面具有重要作用。两个主要的免疫检查点分子一一细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA4)和程序性细胞死亡的蛋白l(H)l)，是具有细胞毒性的T细胞激活的负调节因子。
[0005]CART免疫疗法是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗方法。和其他免疫疗法类似，其基本原理是利用肿瘤患者自身的免疫细胞来清除癌细胞，但与传统免疫治疗方法不同的是，这种细胞疗法利用基因工程技术，通过逆转录病毒和慢病毒载体给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体。然后将这些T细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。目前该免疫疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显示出非常振奋人心的结果，同时针对实体瘤比如乳腺癌以及肝癌等的早期临床实验也显示出了巨大的治疗前景。
[0006]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分组成，位于细胞外的抗原结合区scFv，跨膜区以及胞内信号转导结构域组成。胞外抗原结合区负责抗原的识别，胞内区负责信号的转导，跨膜区连接胞外区和胞内区，对每一个区域的不同设计直接影响CART功能的发挥。膜外区为由单链可变片段(scFv)组成的抗原结合区，可特异性地识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，使CART对肿瘤抗原识别具有非MHC限制性和高亲和力的特点。目前已经设计了能识别多种肿瘤抗原的s cFv，如CD 19、CD20、EGFR、Her 2 /neu、GD2、PSMA、CAIX及RORl等。跨膜区在T细胞活化中起着重要的作用，对跨膜区不同的设计能够影响导入的CAR基因的表达能力。膜内区为细胞内信号转导区，胞外区和胞内区的信号传导结构域相親联，比如CD3G等。当scFv与其识别的抗原结合时，会通过CD3G向胞内传导TCR样的信号，从而刺激CART细胞增殖、杀伤肿瘤细胞以及释放免疫因子。
[0007]其中，根据胞内信号转导结构域的研究发展，CAR从第一代发展到目前第三代。第一代CART仅含有一个信号单元，大多来自于CD3G。然而，这种方式修饰的T细胞只能产生短暂的分裂，扩增倍数少，在体内存活时间短以及分泌的细胞因子较少等缺点，在实际应用中作用有限。第二代CART是在第一代CART的胞内信号转导结构域基础之上增加了一个共刺激结构域，比如CD28、0X40或者4-1BB，以便提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。第三代CART是在第二代CART的胞内结构域基础之上再增加一个共刺激结构域，因此具有两个共刺激结构域，能够进一步提高CART的扩增倍数以及在体内存活的时间，提升肿瘤治疗效果。
[0008]随着对抗原呈递过程研究的深入，研究表明主动免疫治疗是激活自身的免疫系统T细胞或抗原呈递细胞来识别杀伤肿瘤细胞，T细胞的激活需要两个信号:一是MHC-多肽的信号，另一个是共刺激分子的信号，主要有正向共刺激因子⑶27、⑶28和⑶137通路，此外为保证T细胞不被过度刺激，还有调节T细胞不被过度刺激的共抑制分子，主要有CTLA4(cytotoxic T Iymphocyteassociatedantigen 4，CTLA-4)通路和I3DlA3DLl通路，这种抑制性的通路也会被肿瘤利用来对抗免疫系统。在正常生理情况下，共刺激分子与共抑制分子之间的平衡，即免疫检查点分子的平衡，使T细胞的免疫效应保持适当的深度、广度，从而最大程度减少对于周围正常组织的损伤，维持对自身组织的耐受、避免自身免疫反应。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，例如PD-1、PD-L1，抑制T细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤发生、发展。
[0009]目前针对肿瘤的免疫治疗都是单一化的，只有CART或者只有单一的阻断免疫检测点的单克隆抗体。对于CART而言，目前开发的应用于临床实验的产品，为第二代或者第三代CART。第二代以及第三代CART虽然相比于第一代CART在扩增倍数，体内持续时间上有较大提升，但是由于受免疫检测点抑制，T细胞的免疫活性大大降低，造成肿瘤免疫逃逸，导致CART不能够完全有效地杀伤肿瘤细胞，因此仍然不能够满足临床肿瘤治疗，尤其是实体瘤的治疗。目前针对免疫检测点的阻断剂虽然有针对roi/ro-Ll以及CTLA4的单抗，然而，这些单抗也是单一的只针对免疫检测点的试剂，虽然能够增加T细胞的免疫活性，但是不具备真正的靶向杀伤肿瘤细胞的能力。
[0010]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0011]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用，旨在解决现有免疫T细胞嵌合抗原受体不同时具有自行阻挡免疫检测点和特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞的问题。
[0012]本发明的技术方案如下:
一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体由靶序列和与靶序列经过IRES序列连接的阻断免疫检测点的scFv序列组成;其中，所述革El序列由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
[0013]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述阻断免疫检测点的scFv序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
[0014]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述阻断免疫检测点的scFv序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
[0015]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种o
[0016]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。
[0017]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述跨膜序列为CD3ζ。
[0018]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1ΒΒ胞内结构域序列和CD3G序列。
[0019]—种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其中，将如上任一所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外扩增之后回输到患者体内，实现自行阻挡免疫检测点，又特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
[0020]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其中，还包括将阻断免疫检测点的嵌合抗原受体克隆到附加体载体上。
[0021]所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其中，所述附加体为PCEP4或ρΤΤ5ο
[0022]有益效果:本发明利用阻断免疫检测点和嵌合抗原受体疗法的特性集中于一体，联合阻断免疫检测点和特异肿瘤靶向技术，得到一种改造的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体。该阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外大规模扩增之后回输到患者体内，经过改造的T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤靶向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
【附图说明】
[0023 ]图1为本发明免疫T细胞中共同表达CAR模块和H)I抗体示意图。
[0024]图2为本发明的roi的scFv序列示意图。
[0025]图3为本发明的第三代CAR的组成示意图。
[0026]图4为本发明的靶序列和抗PDl的scFv序列经过IRES序列连接并构建在同一个慢病毒表达载体上的示意图。
[0027]图5为本发明改造的嵌合抗原受体构建于载体的流程图。
[0028]图6为本发明改造的嵌合抗原受体克隆至附加体的流程图。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]本发明提供一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体由靶序列和与靶序列经过IRES序列连接的阻断免疫检测点的scFv序列组成;其中，所述靶序列由胞外scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
[0031]本发明具有如下特点:1)、开发针对多种肿瘤比如急性淋巴瘤、肺癌、肝癌以及乳腺癌等单链抗体，目前已经获得了大部分肿瘤的专用scFv序列库，为进一步开发肿瘤治疗奠定了基础。2)、将CART的细胞外的scFv抗原结合序列、跨膜序列、胞内信号转导序列分别单独构建，使相应的序列模块化，能够迅速高效地将scFv抗原结合序列、跨膜序列以及胞内信号转导序列自由组合，便于大规模、短时间筛选出针对特定肿瘤有效的靶序列组合。3)筛选出针对特定肿瘤有效的靶序列之后，本发明将此靶序列和阻断免疫检测点的scFv序列(如，PDl的抗体序列)经过IRES序列连接，然后构建在同一个慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外大规模扩增之后回输到患者体内，经过本发明改造的免疫T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤靶向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
[0032]基于上述阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，本发明还提供一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其中，将如上任一所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外扩增之后回输到患者体内，实现自行阻挡免疫检测点，又特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
[0033 ] 例如，本发明设计模式可以为，在免疫T细胞中共同表达CAR模块和H) I抗体，如同I所示。经过上述基因改造的免疫T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤靶向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
[0034]进一步地，本发明所述阻断免疫检测点的scFv序列(如，PDl的抗体序列)包括轻链可变区序列和重链可变区序列。优选地，本发明所述阻断免疫检测点的scFv序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列(如，Linker)及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
[0035]进一步地，本发明所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin 和 NCAM 中的一种。
[0036]下面仍以阻断免疫检测点的scFv序列为的抗体序列为例进行说明。本发明联合抗ro I以及CART，构建到同一个载体表达。具体地，本发明首先获取ro I的抗体序列，这是由于PDl的抗体太大，核酸序列非常长，在细胞之中难以表达。因此，本发明所使用的PDl的抗体大多数都是采取使用单链抗体(single-chain antibody fragment, scFv)的方法。单链抗体由重链可变区序列(heavy chain variable reg1n , HCVR)和轻链可变区序列(light chain variable reg1n, LCVR)组成，中间有一个18个氨基酸左右的Linker序列连接而成(Linker序列见Seql和Seq2)。由于需要让PDl的scFv序列可溶表达，因此，在其scFv序列之前还需要加一段可溶信号肽序列(signal sequence序列见Seq5h因此，PDl的scFv序列示意图如图2。结果表明:获取了亲和力高的人的抗H)1单克隆抗体，通过氨基酸测序获得了抗单克隆抗体的轻链可变区LCVR序列(ant1-ro1-LCVR序列见Seq3)和重链可变区序列(ant1-FOl-HCVR序列见Seq4) ^Linker序列、signal sequence序列、ant1-FOl-LCVR序列及ant1-PDl-HCVR序列如下。
[0037]Linker sequenceSeql:amino acid sequenceGSTSGSGKPGSGEGSTKG
Seq2:nucleic acid sequence
GGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGC
ant1-PDl-LCVR
Seq3:nucleic acid sequence
Tcctatgagctgactcagccaccctcggtgtcagtgtccccaggacagacggccaggatcacctgttctggagatgcattgccaaagcaatatgcttattggtaccagcagaagccaggccaggcccctgtgatggttatatataaagacactgagaggccctcagggatccctgagcgattctctggctccagctcagggacaaaagtcacgttgaccatcagtggagtccaggcagaagacgaggctgactattattgtcaatcagcagacaacagtattacttatagggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaant1-PDl-HCVRSeq4:nucleic acid sequence
GaggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaagtctcctgcaaggcttctggttacagatttaccagctacggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactacgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaacacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagacgcggattatagtagtgggtctgggtactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaSignal sequence
Seq5:ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA进一步地，在获取抗PDl的scFv序列之后，还需要获得第三代嵌合抗原受体(chimericantigen receptor, CAR)。第三代CAR主要由三部分组成，位于细胞外的scFv抗原结合序列，跨膜序列及胞内信号转导序列组成。细胞外的scFv抗原结合序列负责抗原的识别，胞内信号转导序列负责信号的转导，跨膜序列连接胞外区和胞内区，如图3所示。
[0038]进一步地，胞外区为由单链可变片段(scFv)组成的抗原结合区，抗原结合区可特异性地识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，使CART对肿瘤抗原识别具有非MHC限制性和高亲和力的特点。目前已经设计了能识别多种肿瘤抗原的scFv抗原结合序列库，例如，所述scFv抗原结合序列库有CD19(序列见Seq6)、CD30(序列见Seq7)、CD33(序列见Seq8)、CEA(序列见 Seq9)、cMet(序列见 36910)46?1^111(序列见36911)、？厶？(序列见36912)、Her2(序列见36913)、602(序列见36914)、卩3]\^(序列见36915)、]\^801:1161;[11(序列见36916)及从^]\1(序列见Seql7)等。 TCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTAO
TACTGTGCCMACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCMGGA
ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCA
>nt1-CD30-SCFV
Seq7:
GACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA ACCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCACTTGTCGGGOGAGTCAGGGT ATTAGCAGCT GGTTMCCTG GTATCAGCAG MACCAGAGA 10000?GTCCCTGATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA ?0^-0000^-0 CCATCMGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGGACAGATTTCA 0^0^0>00>^ CAGCAGCCTG CAGCCTGMG ATTTTGCMC TTATTACTGC CMCAGTATGATAGTTACCC TATCACCTTC GGCCAAGGGA CACGACTGGA GATTAAGGCT CCACCTCTGG ATCCGGCAAGCCCGGATCTG GCGAGGGATC CACCMGGGC CAGGTGCAGC TACAGCAGTG GGGCGCAGGA OJQ1Q?QoCTTCGGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCGCTG TCTATGGTGG GTCCTTCAGT GCTTACTACT GGAGCTGGATCCGCCAGCCC CCAGGGMGG GGCTGGAGTG GATTGGGGAC ATCMTCATG GTGGAGGCAC CMCTACMOCCGTCCCTCA AGAGTCGAGT CACCATATCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AAGCTGAACTCTGTMCCGC CGCGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG CCTMCTGCC TACTGGGGCC AGGGMGCCTGGTCACCGTC TCCTCAAnt1-CD33ISCFVSeqS:
gaca1:ccaga1:gacccag1:cr+ccar+ccr+cacr+gr+cr+gca1:c1:gr+aggagacaga g1:cacca1:caar+r+gr+aaggc1:ag1:caggacar+r+aar+agcr+ar+r+r+gagcr+ggr+r+r+cagcag aaaccagggaaagccccr+aagacccr+gar+c1:ar+agagcaaar+agar+r+ggr+agar+ggggr+c Cca1:caaggr+1:c1:c1:ggcag1:gga1:c1:gggcaagar+r+ar+acr+c1:cacca1:cagcagcc1:g
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acatccaccagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgatgacacagctgtg
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Ant1-CEA-scFv
Seq9:
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gccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtgcatctGgctatagttatatgcac
tggtaccaacagagaccaggacagccacccAaactcctcatctatcttgcatccaaccta
caatctggggtccctgccAggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaac
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Ant1-cMet-scFv
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Ant1- EGFRvII1-scFvSeqll:
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGA
GTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAG
AAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTG3ονχν33οοο5χ3χ33333χοχ333χ33ν33333χον333νοχνον33χνχνο
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Ant1-GD2-scFv
Seql4:
CAGGTGAAACTGCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGNAGCCTGGGGCTTCAGTG
AAGATATCCTGCAAGACTTCTGGANACAAATTCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAG
CAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACT
AACTACAAGCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACA
GCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGA
GATACTACGGTCCCGTTTGCTTACTGGGTCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGT
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TCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGGCAGC
TCAAGTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGTCACCTCCCCCAAAAGATGG
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GGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGTAGATGCTGCCACTTATTAC
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CGG
Ant1-PSMA-scFv
Seql5:
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaaga
gccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacag
aaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatc
ccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccta
gagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggctcatgtacact
tttggccaggggaccaagctggagatcaaaGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGA
TCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCgaggtgcagttggtgcagtctggagcagaggtgaaa
aagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagttttaccagctac
tggatcggctgggcgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctat
cctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagcc
gacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgcc
atgtattactgttcggccgctaattcttctcactggtacttcgatctctggggccgtggc
accctggtcactgtctcctca
Ant1-Mesothelin-scFv
Seql6:
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacg
gtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttcc
ggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctgga
gcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggata
tactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagac
tcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcg
gccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattac
tgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctc
tcc
Ant1-NCAM-scFvSeql7:
cccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtctccAtgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggttccaaCagaagccaggatcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacCtggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggaccTcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccactTattactgccagcagtggagtagttacccgctcacgttcggtgatgggAccaagctggagctgaaacgaactgtgGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCaggagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaagatgTcctgcaaggcttctggatacacattcactagctatgttatggactggGtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatatattaatCcttacaatgatggtactaagtacaatgagaagttcaaaggcaaggccAcactgacttcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctcagcAgcctgacctctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcgggtAttacggactttgactactggggccaaggcaccactctcatagtctccTca跨膜区在免疫T细胞活化中起着重要的作用，对跨膜区不同的设计能够影响导入的CAR基因的表达能力。值得注意的是，在跨膜区和scFv抗原结合序列之间还需要加入一段Hinge序列，如图3所示。而经过实验验证简化了这样的繁琐操作，直接采用⑶8分子的胞外铰链结构与和跨膜结构域与scFv抗原结合序列直接相连接(CD8 hinge-transmembrane序列见 Seql8)。
[0040] CD8 hinge-transmembraneSeql8:
TTC GTGCC GGTCT TCCTG CCAGC GAAGC CCACC ACGAC GCCAGCGCCG CGACC ACCAA CACCG GCGCC CACCA TCGCG TCGCA GCCCC TGTCCCTGCG CCCAG AGGCG TGCCG GCCAG CGGCG GGGGG CGCAG TGCAC ACGAGGGGGC TGGAC TTCGC CTGTG ATATC TACAT CTGGG CGCCC TTGGC CGGGACTTGT GGGGT CCTTC TCCTG TCACT GGTTA TCACC CTTTA CTGCA ACCACAGGAA C
胞内区为细胞内信号转导区，胞外区和胞内区的信号传导结构域相耦联，比如跨膜序列为CD3G等，通过CD3G将胞外区和胞内区的信号传导结构域相耦联。当scFv抗原结合序列与其识别的抗原结合时，会通过跨膜序列CD3G向细胞内传导TCR样的信号，从而刺激CART细胞增殖、杀伤肿瘤细胞以及释放免疫因子。由于我们是第三代CART，因此，胞内具有多个信号转导结构域，其中，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列(CD28 endodomain序列见Seql9)，4_1BB胞内结构域序列(4-1BB endodomain序列见Seq20)以及⑶3ζ序列(CD3ζ序列见Seq21)。本发明进一步将上述结构域序列分别单独构建到载体之中，使相应的序列模块化，能够迅速高效地将scFv序列、跨膜序列以及信号转导区序列自由组合，便于大规模、短时间筛选出针对特定肿瘤有效的靶序列组合。其后，本发明进一步将筛选出针对特定肿瘤有效的靶序列和抗I3Dl的scFv序列经过IRES序列连接，构建在同一个慢病毒表达载体上，如图4所示。
[0041 ] CD28 endodomainSeql9:
AGGA GTAAG AGGAG CAGGC TCCTG CACAG TGACT ACATG AACATGACTC CCCGC CGCCC CGGGC CCACC CGCAA GCATT ACCAG CCCTA TGCCCCACCA CGCGA CTTCG CAGCC TATCG CTCC4-1BB endodomainSeq20:
C GTTTC TCTGT TGTTA AACGG GGCAG AAAGA AGCTC CTGTA TATAT TCAAA CAACC ATTTATGAGA CCAGT
ACAAA CTACT CAAGA GGAAG ATGGC TGTAG CTGCC GATTT CCAGA AGAAG
AAGAA GGAGG ATGTG AACTG
CD3G
Seq21:
AGAGT GAAGT TCAGC AGGAG CGCAG ACGCC
CCCGC GTACC AGCAG GGCCA GAACC AGCTC TATAA CGAGC TCAAT CTAGGACGAA GAGAG GAGTA CGATG TTTTG GACAA GAGAC GTGGC CGGGA CCCTGAGATG GGGGG AAAGC CGAGA AGGAA GAACC CTCAG GAAGG CCTGT ACAATGAACT GCAGA AAGAT AAGAT GGCGG AGGCC TACAG TGAGA TTGGG ATGAAAGGCG AGCGC CGGAG GGGCA AGGGG CACGA TGGCC TTTAC CAGGG TCTCAGTACA GCCAC CAAGG ACACC TACGA CGCCC TTCAC ATGCA GGCCC TGCCCCCTCG CTAA
进一步地，将以上设计的带有可溶信号肽和跨膜优化区的roi的ScFV序列以及肿瘤表面抗原特异抗体ScFV的DNA编码序列克隆到整合型的病毒载体(如PLVX慢病毒系列)。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特性:整合入宿主细胞基因组，长期表达;但也有不同于逆转录病毒的组份和特性:比逆转录病毒具有更高的滴度，不仅可以感染分裂期细胞，更重要的，还能感染非分裂期的细胞。这类DNA载体包装成慢病毒之后，感染T细胞可形成具有加强效应的免疫激活抗肿瘤作用的稳定表达株，作用时间比游离的DNA载体。构建好载体之后，包装慢病毒并感染T细胞，体外大规模扩增之后回输到患者体内，经过本发明改造的T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤靶向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞，如图5所示。
[0042]进一步地，附加体是一种在细胞中或以游离态、或以与染色体相结合的状态存在着的遗传结构，它的存在给细胞带来一定的遗传性状，但它们的缺失并不会造成细胞的死亡。以附加体为载体的表达系统可以有高拷贝的形式存在于真核细胞中，而附加体可以通过利用载体上的抗生素抗性基因作为选择压而得以维持，另一方面，由于附加体不整合到细胞的基因组中，所以对细胞本身的基因组没有像整合型病毒的破坏作用，本发明将以上设计的带有可溶信号肽和跨膜优化区的roi的ScFv序列以及肿瘤表面抗原特异抗体ScFv的DNA编码序列克隆到附加体载体上(如pCEP4或pTT5)。附加体的细胞导入可采用磷酸钙、月旨质体、PEI纳米导入技术实现，如图6所示。
[0043]综上所述，本发明提供的一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体及其应用，本发明将阻断免疫检测点和嵌合抗原受体疗法的特性集中于一体，联合阻断免疫检测点和特异肿瘤靶向技术，得到一种改造的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体。该阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外大规模扩增之后回输到患者体内，经过改造的T细胞能够自行阻断免疫检测点，同时又具有特异肿瘤革El向效应，能够实现高效的特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。
[0044]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由靶序列和与靶序列经过IRES序列连接的阻断免疫检测点的SCFv序列组成;其中，所述靶序列由SCFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。2.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述阻断免疫检测点的scFv序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。3.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述阻断免疫检测点的scFv序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。4.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv抗原结合序列为CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。5.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。6.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜序列为CD3 ζ07.根据权利要求1所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1ΒΒ胞内结构域序列和CD3G序列。8.—种阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，将如权利要求1?7任一所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体构建在同一慢病毒表达载体上，包装慢病毒并感染T细胞，体外扩增之后回输到患者体内，实现自行阻挡免疫检测点，又特异靶向CART细胞杀伤肿瘤细胞。9.根据权利要求8所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，还包括将阻断免疫检测点的嵌合抗原受体克隆到附加体载体上。10.根据权利要求9所述的阻断免疫检测点的嵌合抗原受体的应用，其特征在于，所述附加体为PCEP4或ρΤΤ5。
【文档编号】C07K19/00GK105837692SQ201510910606
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月10日
【发明人】陈光风, 刘小青
【申请人】苏州佰通生物科技有限公司