工程化的高亲和力人类t细胞受体的制作方法【专利摘要】提供了对于存活素(Survivin)抗原具有较高亲和力的T细胞受体(TCR)。所述高亲和力TCR通过产生单链形式的突变TCR库、接着针对酵母表面上提高的稳定性和亲和力进行选择(即定向进化)而工程化。在实施例中，所述工程化的TCR可以按可溶形式用于体内靶向递送，或在过继T细胞环境下以基因形式引入T细胞中。【专利说明】工程化的高亲和力人类T细胞受体[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年11月22日提交的美国临时专利申请第61/907,887号的权益，并且此临时申请W全文引用的方式并入本文中。[0003]关于联邦赞助的研究或开发的声明[0004]本发明在美国政府支持下在由国家卫生研究院（NationalInstitutesof胎alth)授予的拨款号R01GM55767和T32GM070421下作出。美国政府拥有本发明的某些权利。[00化]关于序列表的声明[0006]与本申请相关的序列表W文本格式代替纸本拷贝提供，并且在此W引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是IMMU_003_01W0_ST25.txt。文本文件12邸，创建于2014年11月21日，并且W电子方式经由EFS-Web提交。
技术领域：
[0007]本发明设及针对存活素(Survivin)抗原的通过体外技术工程化的高亲和力T细胞受体(TCR);W及制备经修饰的TCR和单链TCR的方法;和所述TCR用于治疗、诊断和成像方法的相应用途。【
背景技术：
】[0008]T细胞受体（TCR)和抗体是已经进化W识别不同类别的抗原（配位体）的分子((Mu巧hy(2012)，xix，第868页））eTCR是负责识别在抗原呈递细胞(APC)或任何有核细胞(例如，体内的除红细胞外的所有人类细胞）的表面上的主要组织相容性复合物(MHC)的产物情境下呈递的抗原肤的抗原特异性分子。相比之下，抗体典型地识别可溶或细胞表面抗原，并且不需要通过MHC呈递抗原。此系统经由其TC则武予T细胞W识别由细胞(包括病毒蛋白质)表达的细胞内抗原的整个阵列的潜在能力，所述细胞内抗原在细胞内加工为短肤，结合到细胞内MHC分子并且W肤-MHC复合物(pepMHC)形式递送到表面。此系统允许几乎任何外源蛋白质(例如，突变癌症抗原或病毒蛋白质)或异常表达蛋白质提供T细胞的标祀(综述于化avis和Bjorkman(1988)《自然(化Uire)》，334,395-402;Davis等人（1998)《免疫学年鉴(AnnuRev11111]111]1〇1)》，16,523-544;111巧117(2012),义;[义，第868页）中）。[0009]TCR与pepMffi：的相互作用可W驱动T细胞成为各种活化状态，取决于结合的亲和力(或解离速率）dTCR识别过程通过提供多样TCR谱系而允许T细胞在正常健康细胞与例如已经经由病毒或恶性肿瘤变得转化的细胞之间进行区别，其中一种或多种TCR针对结合到MHC分子的外源肤W高于用于刺激T细胞活性的阔值的结合亲和力存在的概率很高(Manning和Kranz(1999)《今日免疫学（ImmunoIogyToday)》，20,417-422)。[0010]迄今为止，从通过体外培养鉴别的人类或小鼠T细胞克隆分离的野生型TCR已经显示具有相对低结合亲和力化d=1-300咖)（化avis等人（1998)《免疫学年鉴》，16，523-544)。对此的部分解释似乎是，胸腺中出现的T细胞在自身-pepMHC配位体上被负选择(耐受性诱导），使得缺失具有过高亲和力的T细胞(S化rr等人(2003)《免疫学年鉴》，21,139-76)。为了补偿运些相对低亲和力，T细胞已经进化共同受体系统，其中细胞表面分子CD4和CD8结合到分子(分别II类和I类)并且与TCR在介导信号传导活性方面协同作用。CD8在此过程中特别有效，使得具有极低亲和力(例如，Kd=300山〇的TCR介导有效抗原特异性活性。[0011]在体外，定向进化已经用W产生对于特定pepMHC具有较高亲和力的TCRdS种已经使用的不同呈现方法是酵母呈现化oiler等人（2003)《自然?免疫学(化tImmunol)》，4，55-62;Holler等人（2000)《美国国家科学院院刊（Proc化tlAcadSciUSA)》，97,5387-92)、隧菌体呈现化i等人(2005)《自然?生物技术(NatBiotechnol)》，23,349-54)和T细胞呈现（Chervin等人（2008)《免疫学方法杂志（JImmunolMethods)》，339,175-84)。在所有=种方法中，过程包括使展现野生型TCR的正常低亲和力的TCR工程化或修饰其，使得TCR的突变体的亲和力对于同源pepMHC(T细胞特异性针对的初始抗原)具有增加的亲和力。因此，野生型TCR被用作制备一个或多个CDR中的诱变库的模板，并且具有较高亲和力的突变体通过结合到同源肤-MHC抗原而被选择。[0012]在本发明中，公开了通过酵母呈现而工程化的对存活素癌症抗原具有特异性的高亲和力T细胞受体。存活素蛋白质通过抑制导致正常细胞调亡的信号传导促进瘤形成(DoM等人（2004)《临床调查杂志（JournalOfClinicalInvestigation)》114,1117-1127)。存活素在癌组织中上调(Ambrosini等人（1997)《自然?医学(化tMed)》3,917-921)。其已经成为疫苗工作，和使用具有野生型T细胞受体的T细胞的各种过继T细胞方法的标祀。[0013]存活素肤抗原在由国家癌症研究所(National化ncerInstitute)所列的前75种癌症抗原的优先排序清单中排名第2UCheever等人（2009)《临床癌症研究（ClinCancerRes)》，15,5323-5337)。因此，需要鉴别特异性祀向此癌症抗原的药剂，例如，治疗剂。本发明提供了体外工程化的较高亲和力TCR，其可W例如W可溶形式用于体内祀向递送或在过继T细胞环境下W基因形式引入T细胞中。【
发明内容】[0014]本发明设及一种W提高的亲和力结合到存活素抗原的体外工程化T细胞受体(TCR)。更确切地说，本发明设及通过酵母、隧菌体或哺乳动物细胞的表面上的库的呈现而选择的稳定化和亲和力突变;选自运些库的用于W增加的亲和力结合到抗原的TCR蛋白质；和体外选择的TCR衍生物用于治疗、诊断或成像应用的用途。[0015]本发明的一个方面设及一种经修饰的T细胞受体或其抗原结合片段，其包含来源于野生型T细胞受体的Va和V0，其中所述Va、所述W或运两者相对于所述野生型T细胞受体包含一个或多个互补决定区（CDR)中的突变，其中所述经修饰的T细胞受体结合到称为存活素/HLA-A2的肤/MHC抗原（结合到被称为HLA-A2的MHC产物的存活素肤LMLGEFLKUSEQIDN0:5))。[0016]在一个实施例中，所述经修饰的T细胞受体包括包含与SEQIDN0:3中阐述的Va氨基酸序列具有至少80%-致性的氨基酸序列的经修饰的Va,其中所述经修饰的T细胞受体WlO6M更高的亲和力化A值)结合到存活素/HLA-A2。[0017]在另一实施例中，所述经修饰的T细胞受体包括包含与SEQIDN0:4中阐述的Va氨基酸序列具有至少80%-致性的氨基酸序列的经修饰的Va,其中所述经修饰的T细胞受体WlO6M更高的亲和力化A值)结合到存活素/HLA-A2。[0018]在另一实施例中，所述T细胞受体是包含SEQIDN0:6中阐述的氨基酸序列的单链T细胞受体。[0019]在另一实施例中，所述T细胞受体是包含SEQIDN0:7中阐述的氨基酸序列的单链T细胞受体。[0020]在另一实施例中，所述T细胞受体含有选自SEQIDNO:3中阐述的氨基酸序列的脚25、化001(、41016、1?102￥和1^0：31(的至少一个〔01?〇突变。[0021]在另一实施例中，所述T细胞受体含有选自SEQIDN0:4中阐述的氨基酸序列的脚2山化006、4101胖、3102￥和1^031'的至少一个〔01?3〇突变。[0022]在一个实施例中，所述经修饰的T细胞受体提供体外选择突变T细胞受体的酵母呈现库而产生。[0023]在另一实施例中，所述经修饰的T细胞受体表达为结合到其标祀抗原的可溶蛋白质。[0024]在另一实施例中，经修饰的T细胞受体表达于T细胞表面上W便介导CD4+或CD8+T细胞的活性。[0025]本发明的一个方面设及一种祀向表达存活素抗原的癌细胞的治疗剂，其中所述治疗剂包含本文所述的经修饰的T细胞受体。在一个实施例中，一种祀向表达存活素抗原的癌细胞的治疗剂，其中所述治疗剂包含表达本文所述的经修饰的T细胞受体的人类T细胞。[0026]-个实施例提供了一种治疗患有表达存活素抗原的癌症的受试者的方法，其包含投与本文所述的治疗剂。【附图说明】[0027]图1是展示一种使单链TCR工程化W获得针对肤:HLA.A2的提高的亲和力的方法的图。展示了用W使高亲和力TCR工程化的通用方法。[0028]图2A是展示TCR:P邱M肥复合物(A6;PDB:1A07)的侧视图的3维图。指示a链和0链的可变(V)和恒定(C)区。所展示的结构不包括TCR的化区。HLA-A2(al、a2、a3和的m)W灰色展示，并且化X肤化LFGYPVYV，SEQIDN0:6)W黑色展示。在本发明中检查的A6和存活素TCR都使用Va2片段(基于IMGT命名法，也称为TRAV12)。[0029]图2B是展示肤-MHC(Tax/HLA-A2)上的TCR(CDR)足迹的俯视图的3维图。尽管关于本发明中使用的存活素TCR未描述晶体结构，但迄今为止已经在几乎所有复合物中观察到Va区定位于a2MHC螺旋和肤的N末端上并且W区定位于alMHC螺旋和肤的C末端上的此对角线对接定向。[0030]图3是用于使单链T细胞受体片段(Va-连接子-VP或W-连接子-Va)工程化的酵母呈现系统的示意图。[0031]图4A和4B展示了在用识别V的0的构象表位的抗体分选之后存活素易错库的流式细胞术直方图。将存活素易错库依序用1:10稀释的BChV的OFITCIgG和Al强a巧阳)傅)488山羊抗小鼠IgGd:100)二级抗体分选，总共3次分选。将每次分选之后的酵母细胞的等分试样与1:10稀释的BChV的0-起培育（图4A)。灰色指示仅用二级抗体染色的酵母细胞。将稳定克隆K2相继用1:20稀释的hV02OFITCIgG和AlexaFlour647山羊抗小鼠IgG(I=IOO)二级抗体染色（图4B)。[0032]图5A和5B展示了在用BChV的0和Sur^2M:HLA-A2分选之后存活素CDR3a库的流式细胞术直方图，和两种高亲和力TCR与SurvT2M:HLA-A2的结合。将存活素CDR3a库使用磁性柱，首先用BChV的0(1:10)、接着用MB抗小鼠IgG微珠（1:25)二级抗体分选。然后将存活素CDR3a库相继用IOOnMSur^2M:HLA-A2二聚体（DimerX;获自抓Pharmingen)和MB抗小鼠IgG微珠(1:25)二级抗体分选，总共=次磁性分选。随后将经分离的酵母使用巧光激活细胞分选术（FACS)，相继用IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚体（DimerX;获自BD曲armingen)和AkxaFIuor货647山羊抗小鼠IgGd:100)二级抗体分选。然后将每次分选之后的酵母细胞的等分试样相继与IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚体（DimerX;获自BDPharmingen)和AlcxaFiucn?货647山羊抗小鼠IgG(l:100)二级抗体一起培育（图5A)。灰色指示仅用二级抗体染色的酵母细胞。将在使用FACS第4次分选之后分离的结合改进的克隆K2.4.1(图5B，左图）和K2.4.6(图5B，右图）相继用IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚体（DimeriC;获自抓Pharmingen)和AIcxaFiuor巧647山羊抗小鼠IgG(1:100)二级抗体染色（图5B)。[0033]图6A和6B展示了高亲和力TCR，K2.4.1对于SurvT2M:HLA-A2单体的结合性质。图6A是展示相继用各种浓度的SurvT2M:HLA-A2单体和SA-PEd:100)二级抗体染色的高亲和力scTCRK2.4.1的流式细胞术直方图。图6B是展示图6A中绘制的直方图的平均巧光强度(MFI)值相较于SurvT2M:HLA-A2单体浓度的线图。[0034]图7描绘了存活素特异性化2.4.1和K2.4.6)高亲和力TCR的序列。从CDR库中分离高亲和力单链变异体，然后针对亲和力成熟筛选其。从稳定性库中分离的突变加下划线并且加粗;从亲和力成熟库中分离的突变加框并且加粗。还展示了具有K2酵母呈现克隆中的"稳定化"突变的野生型V区序列。关于ve链展示的氨基酸序列对应于SEQIDN0:12,并且所描绘的连接子序列是SEQIDNO:7。关于Va链展示的氨基酸序列从上到下对应于SEQIDN0:13、巧口2。[00对图8A-8C展示了其中T细胞经K2.4.1TCR转导的T细胞分析的结果。将T细胞从AAD转基因小鼠（运些是如下的小鼠：其具有由HLA-A2的al和a2域和小鼠Db的a3域组成的杂交I类基因；运些AAD小鼠可获自杰克逊实验室(JacksonLaboratories))中分离。将细胞用与抗CD3/抗CD28珠子偶合的珠子活化24小时。将T细胞使用PMP71载体反转录转导，所述载体含有K2.4.ITCR的Va和扣:或连接到鼠类2CTCR的Ca和地域（图8A)。然后将模拟(灰色)和K2.4.1转导（黑线）的T细胞用浓度是20nM的Sur^2M:HLA-A2四聚体染色（图8B)。然后将T细胞在1:化:T下与表达HLA-A2的人类T2细胞和各种浓度的存活素肤一起培育24小时。收集上清液，并且使用化ISA测量IFN-丫释放（图8C)。[0036]图9A和9B是说明从架构库中分离的高亲和力单链TCR的例示性治疗应用的图。图9A描绘了适用作可溶治疗产品的TCR形式的五种实例：1)呈Va-W定向或W-Va定向的单链TCR(突变的高亲和力V域用星号展示）；2)在框内与抗体的恒定区结构域融合的单链TCR;3)与轻链或重链的恒定区的框内免疫球蛋白融合体;4)直接偶合到药物的单链TCR(或2和3中展示的免疫球蛋白融合体）；和5)在框内与单链Fv(Vk连接子-VH)连接W产生双特异性药剂的单链TCR。图9B描绘了将使用高亲和力可变域(V)的基于细胞的疗法的两种实例，所述高亲和力可变域(V)通过酵母呈现分离，克隆到哺乳动物细胞载体中，W便在过继T细胞疗法中按W下形式通过T细胞表达:1)嵌合抗原受体(CAR)中的单链受体和2)全长a和机CR。[0037]序列表的简要说明[003引SEQIDN0:1是W高亲和力结合到存活素A1LA-A2的TCR(存活素-K2.4.1)的经修饰的Va区的氨基酸序列。[0039]SEQIDN0:2是W高亲和力结合到存活素/HLA-A2的TCR(存活素-K2.4.6)的另一经修饰的Va区的氨基酸序列。[0040]SEQIDN0:3是W高亲和力结合到存活素A1LA-A2的单链TCR(存活素-K2.4.1)的氨基酸序列。[0041]SEQIDNO:4是W高亲和力结合到存活素/HLA-A2的另一单链TCR(存活素-K2.4.6)的氨基酸序列。[0042]SEQIDNO:5是存活素抗原的氨基酸序列。[0043]沈QIDNO:6是化X抗原的氨基酸序列。[0044]SEQIDNO:7是连接子的氨基酸序列。[0045]SEQIDNO:8是引物剪接化的多核巧酸序列。[0046]沈QIDNO:9是引物T7的多核巧酸序列。[0047]SEQIDNO:10是用W产生SurvCDR3a库的PreSOE1号的反向引物的多核巧酸序列。[004引SEQIDNO:11是用W产生SurvCDR3a库的PreSOE2号的正向引物的多核巧酸序列。[0049]SEQID^:12是结合到存活素/化4-42的1'0?(存活素-1(2)的￥6区的氨基酸序列。[0050]SEQID^:13是结合到存活素/化4-42的1'0?(存活素-1(2)的化区的氨基酸序列。[0051]SEQIDNO:14是WTl抗原的氨基酸序列。[0化2]SEQIDNO:15是A型流感肤的氨基酸序列。[0053]SEQIDNO:16是变异A型流感肤的氨基酸序列。【具体实施方式】[0054]W下描述希望促进对本发明的理解但并不希望具限制性。[0055]-般来说，本文所用的术语和短语具有其领域公认的含义，其可W参考标准文本、杂志参考文献和本领域的技术人员已知的情境找到。W下定义经提供W阐明其在本发明的情境下的特定用途。[0056]如本文所用，"连接"是指两个基团之间的缔合，其可W是共价或非共价缔合。基团可W使用可变长度肤链、非氨基酸化学基团或如本领域中已知的其它手段连接。连接子区可W是可操作地连接蛋白质或肤的两个功能或结构域的氨基酸序列。[0057]如本文所用，术语"化学治疗剂"是指能够减少或预防一种癌细胞、一群癌细胞、月中瘤或其它恶性组织生长、增殖或扩散的任何物质。所述术语预期还涵盖任何抗肿瘤剂或抗癌剂。[005引如本文所用，术语"有效量"预期涵盖例如医药有效量或治疗有效量的情境。举例来说，在某些实施例中，有效量能够实现筛选分析中的有益状态、有益结果、功能活性或改善临床病况。[0059]如本文所用，术语"癌细胞"预期涵盖如本领域中广泛理解的定义。在一个实施例中，所述术语是指可能会促进人类或动物的癌症的临床病况的异常调节细胞。在一个实施例中，所述术语可W指人体或动物体内或来源于人体或动物体的经培养的细胞系或细胞。癌细胞可W是如本领域中理解的多种多样的分化细胞、组织或器官类型。癌细胞的特定实例包括乳癌、结肠癌、皮肤癌、卵巢癌、白血病、肺癌、肝癌、睾丸癌、食道癌和其它类型的癌症。[0060]如本文所用，"治疗（treating/化eatment)"是指用于获得有益或所要结果、包括并且优选临床结果的方法。治疗可W指改善疾病或病况的症状或延迟疾病或病况的进展。[0061]如本文所用，"预防(prevention/preventing)"是指用于预防、抑制或减少疾病或病况的可能性、疾病或病况的发作或复发的方法。其还指预防、抑制或减少疾病或病况的症状的可能性、疾病或病况的症状的出现或再现，并且其还包括在疾病或病况发作或复发之前减少疾病或病况的强度、作用、症状和/或负担。[0062]如本文所用，"抑制细胞生长"或"抑制细胞增疆'是指降低或中断细胞的生长速率。举例来说，通过抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤的大小的增加速率可能减慢。在其它实施例中，肿瘤可W保持相同大小;或大小减小，即，消退。在特定实施例中，细胞生长或细胞增殖的速率被抑制至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。[0063]术语"野生型"和"wt"在本文中可互换地使用并且关于具有编码从天然存在或未经修饰的TCR(例如，初始或母体T细胞克隆)分离的可变区的氨基酸序列或多核巧酸、对于抗原具有特异性的TCR使用。[0064]在呈现氨基酸序列的图和表中，野生型指示为"wt"。在顶部序列下方呈现的序列中，破折号指示氨基酸与比对的Wt或顶部序列中呈现的氨基酸相同。字母指示已经在所述位置从顶部序列进行取代。[0065]如本文所用，术语"经修饰的"、"变异的"、"突变性"、"突变的"和"衍生的"T细胞受体是指具有与初始或野生型T细胞克隆相比具有一个或多个突变的可变区的TCR序列。经修饰的TCR的实例包括较高亲和力TCR。[0066]编码序列是编码蛋白质的氨基酸序列或功能RNA(例如tRNA或rRNA)的基因或CDNA的一部分。[0067]补体或互补序列意指根据沃森-克里克(Watson-化ick)碱基配对规则与核巧酸的另一序列形成氨键结的双螺旋体的核巧酸的一序列。[0068]下游是指DNA或RNA中的相对位置并且是朝链的3'末端的区。[0069]表达是指将基因转录到结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)中并且随后将mRNA转译到蛋白质中。[0070]如果两个核酸序列来源于单独生物体，无论此类生物体是否是不同物种，只要所述序列不一起W相同排列天然存在于同一生物体中，那么所述序列与彼此是异源的。[0071]同源性是指两个核巧酸或氨基酸序列之间的一致性的程度。[0072]功能上等效于具体例示的TCR序列的氨基酸序列是已经通过单或多氨基酸取代、通过添加和/或缺失氨基酸而修饰或其中一个或多个氨基酸已经被化学修饰，但尽管如此仍保持本发明的细胞结合或可溶TCR蛋白质的结合特异性和高亲和力结合活性的氨基酸序列。功能上等效的核巧酸序列是编码具有与具体例示的细胞结合或可溶TCR蛋白质实质上相同的生物活性的多肤的核巧酸序列。在本发明的情境下，可溶TCR蛋白质不具有天然细胞结合TCR的部分并且在溶液中稳定（即，当如本文所述并且在用于蛋白质溶液的标准条件下处置时，其在溶液中通常不凝集）。[0073]术语"经分离的"是指通过人力从天然状态改变的组合物、化合物、物质或分子。举例来说，如果天然存在的组合物或物质已经从其初始环境有所改变或从其初始环境移出或运两种情况都有，那么其是经分离的。举例来说，在所述术语用于本文中时，天然存在于活动物中的多核巧酸或多肤不是经分离的，但与其天然状态的共存物质分离的相同多核巧酸或多肤是经分离的。[0074]核酸构筑体是从天然存在的基因分离或已经被修饰W含有核酸的W否则将不天然存在的方式组合和并列的片段的核酸分子。[0075]核酸分子意指含有通过3'-5'憐酸二醋键连接的脱氧核糖核巧酸或核糖核巧酸的单或双链线性多核巧酸。[0076]如果连接的性质不干扰两个DNA序列相对于彼此影响其正常功能的能力，那么所述序列可操作地连接。举例来说，如果启动子能够实现编码序列的转录，那么启动子区将可操作地连接于编码序列。[0077]多肤是通过肤键连接的氨基酸的线性聚合物。[0078]术语"启动子"是指通常80-120个碱基对长并且位于基因的起始位点上游的顺式作用DNA序列，RNA聚合酶可W结合到其并且起始正确转录。可W存在提供转录的开/关调节和/或增强(增加)下游编码序列的表达的相关额外转录调节序列。[0079]重组核酸分子(例如重组DNA分子)是在体外通过两个或更多个非同源DNA分子的连接形成的新颖核酸序列（例如含有克隆到至少一个克隆位点中的外源DNA的一个或多个插入片段的重组质体）。[0080]术语"转化"和"转染"是指通过外部应用来自另一不同基因型细胞的经纯化的重组DNA定向修饰细胞的基因组，导致其吸收并且整合到受试细胞的基因组中。在细菌中，重组DNA典型地不整合到细菌染色体中，而是自主地复制为质体。术语"经转化的"和"经转染的"在本文中可互换地使用。举例来说，T细胞可W在过继T细胞处理之前用编码本文所述的经修饰的或高亲和力的TCR的DNA序列转染。[0081]上游意指在DNA或RNA中的任何位点的5'侧上。[0082]载体是能够在宿主细胞中自主地复制并且可W接受外源DNA的核酸分子。载体携有其自身的复制起点；一个或多个可W用于插入外源DNA的限制性核酸内切酶的独特识别位点；W及通常可选标记，例如编码抗生素抗性的基因，和通常用于表达插入的DNA的识别序列(例如，启动子）。常见载体包括质体载体和隧菌体载体。[0083]高亲和力T细胞受体(TCR)是比野生型TCR更强地结合到标祀配位体的工程化TCR。高亲和力的一些实例包括对于标祀配位体在约ICT6M与1()-1?之间W及为其中的所有个别值和范围的平衡结合常数。此范围涵盖据报道为野生型亲和力QCT4到的亲和力与已经通过定向进化分离的亲和力(约I(Ti2M)之间的亲和力。[0084]细胞因子是通过影响其它细胞的细胞制备的蛋白质、肤或糖蛋白。[0085]哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。[0086]本领域的技术人员应了解，由于遗传密码的简并，众多功能上等效的核巧酸序列编码相同氨基酸序列。[0087]T细胞受体[0088]T细胞受体(TCR)由在T细胞表面上配对W形成异源二聚受体的两条链(曰0或丫S)组成。a机CR表达于体内的大多数T细胞上并且已知参与识别M肥限制抗原。a机CR的分子遗传学、结构和生物化学现在已经得到透彻的研究。每条a和e链由两种结构域组成:错定细胞膜中的蛋白质并且与CD3信号传导装置的恒定亚单位缔合的恒定域(C)，和通过六个环(称为互补决定区（CDR))赋予抗原识别的可变域(V)。每一个V域具有S个CDR。运些CDR与结合到由主要组织相容性复合物编码的蛋白质的抗原肤之间的复合物（pepMHC)相互作用(Davis和Bjorkman(1988)《自然》，334，395-402;Davis等人（1998)《免疫学年鉴》，16，523-544;Mu巧hy(2012)，xix,第868页）。[0089]TCR的分子遗传学已经展现了组合W形成V域的编码区的多种基因之间的遗传重组的过程。所述过程类似于抗体发育，其中重和轻链基因重排W产生由B细胞衍生的抗体展现的巨大多样性(Tonegawa(1988)《体外细胞发育生物学（InVitroCellDevBiol)》，24，253-65)。在T细胞的情况下，a链V域通过将一个V区（在人类中约75之中）与一个连接(J)基因片段(在人类中约61之中）重排而形成（图5.8Janeway,第8版）。0链V域通过将一个V区(在人类中约52之中）与一个多样性(D)基因（在人类中2之中）与一个连接(J)基因片段(在人类中13之中）重排而形成（图5.8，（Mu巧hy(2012)，XiX，第868页））。VaJa与V抓0扣基因重排的连接点编码每条链的CDR3环，并且其促进a机CR的巨大多样性，理论极限是超过l〇is个不同TCR(Davis和Bjorkman(1988)《自然》，334,395-402)，远高于人类中可实现的多样性，因为总计仅存在约1011个T细胞(Mason(1998)《今日免疫学》，19,395-404)。每条链的可能CDRl和CDR2多样性通过V基因的数目表示，因为运些环编码于V基因内，并且TCR不经历体内体细胞突变。尽管CDRl和CDR2环的多样性与CDR3环相比相对有限，但已经有多个实例显示其中基于肤抗原和/或血IC产物对于特定V区已经存在选择。[0090]I类MHC产物结合到8到10个氨基酸长度的肤并且其表达于体内的所有有核细胞上(由（Rock和Gol化erg(1999)《免疫学年鉴》，17,739-79)综述）。尽管抗体-抗原相互作用的全部结合能都集中于外源抗原上，但TCR-肤:MHC的相当大部分的结合能引导于自身-MHC分子处(Manning和Kranz(1999)《今日免疫学》，20，417-422)。实际上，更为新近的研究已经提出，CDRl和/或CDR2环的特定残基已经进化W与M肥螺旋上的特定残基相互作用，因此提供对于MHC的基础亲和力，解释M肥限制的过程(Garcia等人(2009)《自然?免疫学》，10,143-7;Marrack等人（2008)《免疫学年鉴》，26，171-203)。[0091]已经关注了使用对于肤-MHC抗原（I类)具有高于正常范围的亲和力的TCR(所谓的较高亲和力TCR)，W便：U驱动CD4辅助T细胞(其不具有CD8共同受体)的活性;或2)使可W用于直接祀向细胞的可溶TCR发育，通过连接"效应子"分子(例如，抗体化区、毒性药物或抗体scFv，例如抗CD3抗体，W形成双特异性蛋白质）（（Ashfield和Jakobsen(2006)ID;rugs,9，554-9;Foote和Eisen(2000)《美国国家科学院院刊》，97,10679-81;Holler等人(2000)《美国国家科学院院刊》，97,5387-92;MolIoy等人（2005)《药理学当前观点（CurrOpin曲armacol)》，5，438-43;Richman和Kranz(2007W生物分子工程（Biomol化g)》，24，361-73)。此方法还可W克服一些癌症患者面临的问题，由此其T细胞对于潜在肿瘤抗原不W充足特异性和结合亲和力表达TCR(部分由于耐受性的胸腺和周边过程）。举例来说，现在已经鉴别了超过300种M肥限制的T细胞界定的肿瘤抗原kancerimmunity.o巧/peptide/)(Boon和01d(1997)《免疫学当前观点(CurrOpinImmunol)》，9，681-3;Cheever等人(2009)《临床癌症研究》，15，5323-37)。运些肿瘤抗原包括突变肤、分化抗原和过度表达的抗原，其都可W充当疗法的标祀。因为迄今为止描述的大多数癌症抗原来源于在MHC分子的情境下仅可W在细胞表面处祀向的细胞内蛋白质，所WTCR在其已经进化W识别此类别的抗原时成为治疗剂的理想候选物。[0092]类似地，TCR可W检测已经于感染细胞中天然加工并且由M肥分子呈现于细胞表面上的来源于病毒蛋白质的肤。在过去25年中已经鉴别立多种病毒抗原标祀，包括来源于HIV和HTLV中的病毒基因组的肤(例如，Addo等人(2007)《公共科学图书馆?综合(PLoS0肥)》，2，e321;Tsomides等人（1994)《实验医学杂志（JExpMed)》，180，1283-93;Utz等人（1996)《病毒学杂志(JVirol)》,70,843-51)。然而，患有运些疾病的患者可能不具有对于感染细胞的结合和摧毁最优的TCR。最终，有可能TCR可W用作自体免疫标祀的受体括抗剂;或在高度特异性的过程中用作免疫抑制局部免疫细胞反应，因此避免一般性免疫抑制的递送药剂((MolIoy等人（2005M药理学当前观点》，5,438-43;Stone等人（2012M蛋白质工程(ProteinEngineering)》））。[0093]经修饰的T细胞受体[0094]定向进化已经用W产生对于特定pepMHC具有较高亲和力的TCRdS种已经使用的不同呈现方法是酵母呈现（Holler等人（2003)《自然?免疫学》，4,55-62;化Iler等人(2000)《美国国家科学院院刊》，97,5387-92)、隧菌体呈现化i等人(2005)《自然?生物技术》，23，349-54)和T细胞呈现(Chervin等人（2008)《免疫学方法杂志》，339，175-84)。在所有S种方法中，过程包括使展现野生型TCR的正常低亲和力的TCR工程化，W便TCR的突变体对于特定pepMHC(即，对于T细胞特异性针对的初始抗原）具有增加的亲和力。因此，野生型TCR被用作制备一个或多个CDR中的诱变库的模板，接着通过结合到同源肤-MH讨亢原选择具有较高亲和力的突变体。本领域中众所周知，为了使亲和力工程化W便高于野生型亲和力超过仅几倍，此类体外定向进化是必需的。[00M]酵母呈现允许相关蛋白质WAga2融合体形式表达于表面上（Boder和Wittr叩(1997)《自然?生物技术》，15,553-557;Boder和Wittr叩（2000)《酶学方法（MethodsEnzymol)》，328，430-44)。此系统已经成功地用于使较高亲和力TCR、单链抗体、纤连蛋白和其它蛋白质工程化。在酵母呈现系统中，TCR已经呈现为呈W-连接子-Va或Va-连接子-W形式的稳定化单链蛋白质（Aggen等人（2011)《蛋白质工程、设计与选择（ProteinEngineering,Desi即，&Selection)》，24,361-72;Holler等人（2000)《美国国家科学院院刊》，97,5387-92;Kieke等人（1999W美国国家科学院院刊》，96,5651-6;Richman等人(2009)《分子免疫学(MolImmunol)》，46,902-16;Weber等人（2005)《美国国家科学院院刊》，102,19033-8)，或二链异源二聚体(Aggen等人(2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24，361-72;Richman等人(2009)《分子免疫学》，46,902-16)。两种小鼠TCR已经使用此系统工程化W获得更高亲和力：2C(I类M肥限制）和3丄2(11类MH邱良制KHoller等人(2000)《美国国家科学院院刊》，97,5387-92;胖666'等人(2005)《美国国家科学院院刊》，102，19033-8)。人类TCR单链VaVP片段(称为SCTv或scTCR)最近也已经通过利用人类Va区（称为Va2,通过IMGT命名法也称为TCRA12)的优越稳定性而开发(Aggen等人(2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24,361-72)。在此情况下，呈单链形式的体外工程化的高亲和力T细胞受体用W分离人类稳定化SCTv片段(W-连接子-Va),其可W在酵母表面上和从大肠杆菌W可溶形式表达为稳定蛋白质。TCR包括两种稳定化人类SCTv片段，A6scTv，其对来源于人类T细胞淋己病毒化X蛋白质的肤具有特异性；和868scTv，其对来源于人类免疫缺陷病毒Gag蛋白质的肤（肤：SL977-85)具有特异性。运两种TCR都使用Va2基因（IMGT:TRAV12家族），但其具有来源于初始T细胞克隆的CDR3a、CDRie、CDR20和CDR30残基，TCR从所述初始T细胞克隆分离。因此，运些scTCR的较高亲和力突变体各自针对其同源肤-MHC抗原来源于其初始(亲本)TCR。[0096]在第二系统（隧菌体呈现）中，相关蛋白质与病毒外壳蛋白的N末端融合(Scott和Smith(1990)《科学（5^611。6)》，249,386-90)。各种1'〇?，包括称为46、868和164的那些（1类限制）已经使用此方法工程化W获得更高亲和力化i等人(2005)《自然?生物技术》，23，349-54;Sami等人（2007)《蛋白质工程、设计与选择》，20，397-403;Varela-Rohena等人(2008)《自然?医学》，14,1390-5)。运些TCR的隧菌体呈现通过在两个C域之间引入非天然二硫键W便促进a和e链的配对而实现。此系统因此使用来源于初始T细胞克隆的全长(VaCa/Ve地)异源二聚蛋白质W便针对其同源肤-MHC工程化。[0097]已经报道用于使TCR工程化的第S系统是哺乳动物细胞呈现(化ervin等人(2008)《免疫学方法杂志》，339,175-84Vessels等人(2000)《美国国家科学院院刊》，97,14578-83)。此系统使用反转录病毒载体将TCRa和0链引入TCR阴性T细胞杂交瘤中。在一个研究化essels等人(2000)《美国国家科学院院刊》，97,14578-83)中，所选突变TCR显示为结合到结构上极类似于同源肤的肤(AS肥NMDAM相较于AS肥NMETM;分别是SEQIDNO:15和16)。在其它研究中，突变TCR的亲和力显示为对于同源P邱MHC增加(化ervin等人(2008)《免疫学方法杂志》，339,175-84)。在许多研究中已经显示，此类较高亲和力TCR针对同源肤的结构类似变异体也展现更高亲和力（例如，化oiler等人(2003)《自然?免疫学》，4,55-62))。在哺乳动物细胞呈现系统中，引入的TCRW其天然构象表达于表面上，与CD3亚单位复合，允许完全功能性T细胞(信号传导感受态）。其天然宿主中的全长异源二聚TCR因此使用此方法工程化。[0098]结合到存活素/HLA-A2的高亲和力TCR[0099]本发明提供了针对熟知的癌症抗原存活素/HLA-A2的高亲和力TCR。在某些实施例中，工程化的TCR可W按可溶形式用于体内祀向递送，或在过继转移方法或治疗中由T细胞重组表达。在一个特定实施例中，单链Vave形式的TCR(scTCR)架构可WW有效载荷制备和使用，例如细胞因子、毒素、放射性同位素、化学治疗剂或药物(类似于抗体-药物结合物），W将效应分子递送到TCR结合的位置(例如，肿瘤）"TCR还可W用于细胞疗法，例如CD4巧细胞、CD8巧细胞和/或自然杀手(NK)细胞的过继转移，W介导针对表达存活素的癌细胞的反应。本文所提供的scTCR架构还可W用于经由通过共价连接(例如通过TCR的胺反应性或琉基反应性氨基酸侧链巧Ij可检测基团（例如放射性同位素或巧光部分)鉴别例如寶生性或病毒相关的细胞表面抗原，来诊断例如恶性或病毒感染的细胞。[0100]在一个实施例中，本文所述的scTCR蛋白质可呈现于酵母、隧菌体或哺乳动物细胞的表面上，并且可W用W使TCR工程化W对于存活素抗原具有甚至更高亲和力。在一个实施例中，本文所述的scTCR蛋白质可W表达于例如W下各者中：原核细胞，例如大肠杆菌、黑曲霉（AspergiIlusniger)、无花果曲霉（AspergiIlusficuum)、泡盛曲霉（AspergiIlusawamori)、米曲霉（Aspergillusoryzae)、里氏木霉（Trichodermareesei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、乳酸克鲁维酵母化Iuyveromyceslactis)、己斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)或地衣芽抱杆菌（BaciIlusIicheniformis);昆虫细胞（例如，黑腹果蛹（DrosophiIamelanogaster));哺乳动物细胞，包括细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞系(CHO);或植物物种(例如，芥花、大豆、玉米、±豆、大麦、黑麦、小麦），或其它本领域已知的蛋白质表达来源，并且大量产生。举例来说并且仅作为实例，TCR还可W用W检测细胞表面上的特定肤/MHC。在一个实施例中，所公开的scTCR基因可W通过使用编码于DNA构筑体内的适合肤序列连接到用于信号传导域的基因，并且引入可能会消除标祀细胞的T细胞中。运些构筑体已经被称为嵌合抗原受体(CAR)，其现在普遍地用于包括使用含有scTCR的CAR的领域中。[0101]在所提供的单链VaWTCR蛋白质中，可变a和可变0链使用任何适合肤连接子连接，所述肤连接子包括本领域中已知的那些，例如抗体单链Fv键(Bird等人(1988)《科学》，242，423-426;Holliger等人（1993)《美国国家科学院院刊》，90,6444-8;Hoogenboom(2005)《自然?生物技术》，23，1105-16;Turner等人（1997)《免疫学方法杂志》，205，43-54)。在一个实施例中，提供了一种具有W下结构的可溶人类单链TCR:VaA-W或WA-Va，其中L是将W与Va连接的连接子肤，Ve是TCR可变0区，并且Va是TCR可变a区。[0102]在一个实施例中，VPVaTCR被称为存活素K2.4.1，其中W是第20组的TCR可变0区，并且Va2是第2组的TCR可变a区化tz，U.等人，1996)(Aggen，D.A.等人,2011)。在一个实施例中，WVaTCR被称为存活素K2.4.6，其中W是第20组的TCR可变0区，并且Va2是第2组的TCR可变曰区。[0103]在一个实施例中，连接子肤含有超过5个赖氨酸残基。在一个实施例中，连接子肤含有5与30个之间的氨基酸。在一个实施例中，连接子肤具有GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQIDN0:7)的氨基酸序列。在一个实施例中，所提供的SCWVaTCR不含有恒定区。当术语SCWVaTCR用于本文中时，应理解，SCWVaTCR也包括为本领域中理解和使用的术语。因此，W和Va链可W通过连接子W任何构形彼此连接。[0104]在本发明的一个方面，本发明的WVaTCRW约ICT6M与ICTi2M之间的平衡结合常数Kd特异性结合到配位体。在本发明的此方面的一个实施例中，配位体是肤/MHC配位体。在一个实施例中，与正常野生型TCR的亲和力相比，本发明的WVaTCR对于配位体具有增强的亲和力。[0105]生物活性基团[0106]还提供了包括生物活性基团的如本文所述的VPVaTCR蛋白质。如本文所用/'生物活性基团"是在生物系统中导致可测量或可检测的作用的基团。在一个实施例中，生物活性基团选自：抗肿瘤剂，例如(但不限于)血管生成抑制剂、酶抑制剂、微管抑制剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂;细胞因子，例如（但不限于）比-2、比-15、GM-CSF、化-12、TNF-a、IFN-丫或LT-a(Schrama等人（2006)《自然评论药物发现（化tRevDrugDiscov)》，5,147-59;Wong等人（2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24,373-83);抗炎基团，例如（但不限于）TGF-0、化-37、比-10(Nold等人（2010)《自然?免疫学》，11,1014-22;Stone等人（2012)《蛋白质工程》）；放射性同位素，例如(但不限于)Wy或UiKReiched和化lge-Archer(2007)《自然评论药物发现》，6,349-56);毒素，例如(但不限于)假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素或一连串的藍麻毒素(Pastan等人(2006)《自然评论:癌症(NatRevCancer)》，6，559-65;Sc虹ama等人(2006)《自然评论药物发现》，5，147-59);药物;或抗体，例如单链Fv。[0107]在本发明的此方面的一个实施例中，生物活性基团是细胞毒性分子，有时称为药物(例如，在术语"抗体药物结合物"中）。如本文所用，"细胞毒性"意指对细胞有毒性。细胞毒性分子的实例包括(但不限于）多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶岭(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、5-氣尿喀晚、倍癌霉素（duocarmycin)、奥瑞他汀(au;ris1:atins)、美登素(111日八日]13；[]163)、卡奇霉素（。日1；[证6日111；[(3；[]13)和^上分子的类似物〇日1'￥13(2012)《化学与工程新闻（化emicalandEngineering化WS)》，90,12-18;Litvak-Greenfeld和Benhar(2012)《先进药物输送评论(AdvDrugDelivRev)》;Rica;rt和Tolche;r(2007)《自然?临床实践肿瘤学(化tClinPract化col)》，4,245-55)。细胞毒性分子不需要导致完全细胞死亡，而是导致生长的可测量或可检测的抑制或细胞活性的降低。[0108]在一个实施例中，本文所述的TCR连接到能够将前药转化为药物的酶。运例如通过使得药物的活性形式在由TCR祀向的位置处(例如，在肿瘤位点处)产生而是适用的。[0109]在一个实施例中，生物活性基团通过连接子结合到单链TCR，运可W通过例如与TCR的游离胺基或琉基的标准化学反应来实现。[0110]在另一实施例中，TCR连接到单链抗体片段(SCFv)W产生双特异性药剂。含有一个针对肿瘤抗原的scFv和一个针对T细胞的CD3分子的scFv的双特异性抗体现在已经成功地用于临床(Bargou等人(2008)《科学》，321,974-7)。另外，还已经报道了含有TCR和针对CD3的SCFv的双特异性药剂化iddy等人(2012)《自然?医学》，18,980-7)。[0111]还提供了一种包括可检测基团的如本文所述的单链VPVaTCR。在一个实施例中，可检测基团是可W通过光谱学或基于酶的方法检测到的基团。在一个实施例中，可检测基团是巧光基团，例如(但不限于）巧光素、R-藻红蛋白（PE)、阳-切5、PE-切7、德克萨斯红(Texasred)或别藻蓝蛋白（APC);经放射性标记的基团，例如(但不限于）125I、32P、99mTc;吸收基团;或具有产生可检测产物的性质的酶，例如(但不限于)辣根过氧化物酶或碱性憐酸酶。[0112]如本领域中已知，生物活性基团、可检测基团或连接到TCR的其它基团可W使用柔性肤连接子或通过化学结合连接，并且可W共价或非共价连接到TCR。[0113]本文还提供了一种人类TCR，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包含向哺乳动物投与有效量的连接到治疗有效分子的经修饰的TCR。在一个特定实施例中，哺乳动物是人类。在另一实施例中，哺乳动物是伴侣动物(例如，狗、猫、兔、晒齿动物、马)或牲畜动物(例如，奶牛、马、猪）。[0114]还提供了一种如本文所述的经分离的单链TCR(scTCR)，和一种在大肠杆菌中制备单链TCR的方法。还提供了一种医药组合物，其包含如本文所述的scTCR和医药学上可接受的载剂。[0115]还提供了已经连接到信号传导域的本文所述的SCVaVPTCR,其在T细胞的表面上产生活性TCR。在一个实施例中，此scTCR可W用于治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包含:将TCR克隆到载体中，将载体引入患者的T细胞中，和将T细胞过继转移回患者中。[0116]经修饰的TCR多肤和多核巧酸[0117]本发明涵盖一种DNA载体，其包括至少一个编码单链T细胞受体（scTCR)的DNA片段。[0118]通过标准诱变技术，结合本文所述的分析，本领域的技术人员可W获得改变的TCR序列并且针对特定结合亲和力和/或特异性测试其。本领域中已知的适用诱变技术包括(但不限于)从头基因合成、寡核巧酸定向诱变、区域特异性诱变、连接子扫描诱变和通过PCR的定点诱变(参看例如Sambrook等人（1989)和Ausubel等人（1999))。[0119]在获得经修饰的TCR编码序列时，本领域的普通技术人员将认识到，TCR衍生的蛋白质可W通过某些氨基酸取代、添加、缺失和转译后修饰，在不损失或降低生物活性的情况下修饰。具体来说，众所周知，保守氨基酸取代（即，用一种氨基酸取代具有类似大小、电荷、极性和构象的另一氨基酸)不大可能显著改变蛋白质功能。为蛋白质的成分的20种标准氨基酸可W广泛分类为如下四组保守氨基酸:非极性(疏水性)组包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和鄉氨酸;极性(不带电、中性)组包括天冬酷胺、半脫氨酸、谷氨酷胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电（碱性)组含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸;并且带负电（酸性)组含有天冬氨酸和谷氨酸。蛋白质中用一种氨基酸取代同一组内的另一氨基酸不大可能对蛋白质的生物活性具有不良影响。[0120]在一个实施例中，本发明的scTCR可W在产生稳定化蛋白质的可变域的任何区域中含有额外突变。在一个实施例中，一个或多个额外突变在〔031、〔01?2、^4、〔01?^1?2和尸尺3中的一者或多者中。用于诱变的区域可W通过定向进化确定，其中晶体结构或分子模型用W产生TCR的与所关注的配位体(例如抗原)相互作用的区域。在其它实例中，可变区可W通过添加或缺失氨基酸W使scTCR与配位体之间的所要相互作用工程化而再成形。[0121]本发明的多肤包括经修饰的TCR和其抗原结合片段(例如，scTCR)和嵌合抗原受体(CAR)。术语"多肤"、"蛋白质"和"肤"和"糖蛋白"可互换地使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸聚合物。所述术语不排除例如肉豆違酷化、硫酸化、糖基化、憐酸化W及信号序列的添加或缺失的修饰。术语"多肤"或"蛋白质"意指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肤键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肤或蛋白质可W包含多条通过肤键非共价和/或共价连接在一起的链，所述链具有天然蛋白质（即，通过天然存在的并且具体地说非重组细胞产生的蛋白质）或遗传工程化或重组细胞的序列；并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有对一个或多个天然序列氨基酸进行的缺失、添加和/或取代的分子。术语"多肤"和"蛋白质"具体地说涵盖本发明的经修饰的TCR或其抗原结合片段，或具有对经修饰的TCR或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸进行的缺失、添加和/或取代的序列。因此，"多狀'或"蛋白厭'可W包含一条(被称为"单体'）或多条(被称为"多聚体'）氨基酸链。[0122]本文中提及的术语"经分离的蛋白质"意指如下受试蛋白质：（1)不含至少一些其它蛋白质，其将与所述其它蛋白质一起典型地在自然界中找到，（2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种）的其它蛋白质，（3)由来自不同物种的细胞表达，（4)已经从至少约50%的多核巧酸、脂质、碳水化合物或其它物质分离，其与所述物质在自然界中缔合，（5)与蛋白质部分不缔合(通过共价或非共价相互作用），"经分离的蛋白质"与所述蛋白质部分在自然界中缔合，（6)与多肤可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用），其与所述多肤在自然界中并不缔合，或（7)不存在于自然界中。此类经分离的蛋白质可W由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，可W是合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，经分离的蛋白质实质上不含见于其天然环境中并且将干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或其它）的蛋白质或多肤或其它污染物。[0123]在特定实施例中，受试经修饰的TCR可W具有:a)具有与本文所述的经修饰的TCR的a链可变区至少80%-致、至少85%-致、至少90%、至少95%或至少98%或99%-致的氨基酸序列的TCRa链可变区；和b)具有与本文所述的经修饰的TCR的0链可变区至少80%-致、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%或99%-致的氨基酸序列的齡连可变区。[0124]在特定实施例中，经修饰的TCR可W包含:a)包含W下各者的TCRa链可变区：i.氨基酸序列与本文所述的所选TCR的a链CDRl区一致的CDRl区；ii.氨基酸序列与所选TCR的a链CDR2区一致的CDR2区；和iii.氨基酸序列与所选TCR的a链CDR3区一致的CDR3区；W及b)包含W下各者的e链可变区：i.氨基酸序列与所选TCR的0链CDRl区一致的CDRl区；ii.氨基酸序列与所选TCR的0链CDR2区一致的CDR2区；和iii.氨基酸序列与所选TCR的0链CDR3区一致的CDR3区；其中TCR特异性结合所选非同源抗原。在另一实施例中，经修饰的TCR或其抗原结合片段是变异的经修饰的TCR，其中除了Va和VP区的CDR区中的多达8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代W外，变异体包含与所选经修饰的TCR-致的a链和0链。就此来说，所选变异的经修饰的TCR的CDR区中可W存在1、2、3、4、5、6、7、8个、或在某些实施例中9、10、11、12、13、14、15个更多个氨基酸取代。取代可W在CDR中Va和/或W区中。（参看例如Muller,1998,《结构（StrucUire)》6:1153-1167)。[0125]在一个实施例中，提供了一种多核巧酸，其编码经修饰的TCR或其抗原结合片段。在其它相关实施例中，多核巧酸可W是编码经修饰的TCR的多核巧酸的变异体。多核巧酸变异体与编码本文所述的经修饰的TCR的多核巧酸序列可W具有实质一致性。举例来说，多核巧酸可W是使用本文所述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析，如下文所描述），与参考多核巧酸序列（例如编码本文所述的TCR的序列）相比包含至少70%序列一致性、优选至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列一致性的多核巧酸。本领域的技术人员将认识到，运些值可W适当地调整，W便通过考虑密码简并、氨基酸类似性、阅读框架定位等，确定由两个核巧酸序列编码的蛋白质的相应一致性。[0126]典型地，多核巧酸变异体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选使得由变异的多核巧酸编码的TCR的结合亲和力相对于由本文具体阐述的多核巧酸序列编码的抗体并不实质上降低。[0127]当比较多核巧酸序列时，如果如下文所描述，两个序列中的核巧酸的序列当经比对W获得最大对应性时相同，那么两个序列被称为"一致的"。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗口比较序列W鉴别和比较局部区的序列类似性来进行。如本文所用，"比较窗口"是指至少约20个、通常30到约75个、40到约50个邻接位置的片段，其中在两个序列经最优比对之后，序列可W与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。[0128]用于比较的序列的最优比对可W使用默认参数，使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序（DNASTAR公司，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))来执行。此程序体现了W下参考文献中描述的若干比对方案=Dayhoff，M.0.(1978)用于检测远缘关系的蛋白质-基质的进化变化的模型（Amodelofevolutionarychangeinproteins-M曰tricesfordetectingdistentrel曰tionships).D曰yhoff,M.0.(编）蛋白质序列和结构地图集(AtlasofProteinSequenceandShucture),国家生物医学研究基金会（化tionalBiomedicalResearch!^undation),华盛顿哥伦比亚特区（WashingtonDC)第5卷，增刊3,第345-358页;胎inJ.，比对和系统发育的通用方法化nifiedApproachtoAlignmentandF*hylogenes),第626-645页（1990);《酶学方法》第183卷,学术出版公司(AcademicPress,Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥（SanDiego,CA);Higgins,D.G.和化a巧，P.M.,CABIOS5:151-153(1989);Myers，E.W.和MullerW.,CABIOS4:11-17(1988);Robinson，E.D.，《组合疗法（Comb.Theor)》l1:105(1971);Santou，N.化S，M.，《分子生物学与进化(Mol.Bio1.Evo1.)M:406-425(1987);Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，《数值分类法-数值分类法的原理与实践（NumericalTaxonom}f-thePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy)》，弗里曼出版社（FreemanPress),加利福尼亚州旧金山（SanFrancisco,CA)(1973);WHbur，W.J.和Lipman，D.J.，《美国国家科学院院刊》80:726-730(1983)。[0129]或者，用于比较的序列的最优比对可W通过Smith和Waterman,Add.A化.Math2:482(1981)的局部一致性算法、通过化edleman和Wunsch,《分子生物学杂志（J.Mol.Biol.)》48:443(1970)的一致性比对算法、通过化arson和Lipman，《美国国家科学院院刊》85:2444(1988)的类似性方法检索、通过运些算法的计算机化实施方案(威斯康星遗传学软件包，遗传学计算机组(GeneticsComputerG;roup，GCG),575ScienceDr.,威斯康星州麦迪逊中的GAP、BEST門T、BLAST、FASTA和TFASTA)或通过检查来执行。[0130]适用于确定序列一致性百分比和序列类似性的算法的一个优选实例是化AST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》25:3389-3402(1977)和Altschul等人，《分子生物学杂志》215:403-410(1990)中。BLAST和BLAST2.0可W例如W本文所述的参数使用W确定两种或更多种多核巧酸之中的序列一致性百分比。用于进行化AST分析的软件通过美国国家生物技术信息中屯、（NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开可用。在一个说明性实例中，对于核巧酸序列，累积得分可W使用参数M(-对匹配残基的奖励得分;始终〉0)和N(错配残基的惩罚得分;始终<0)计算。当累积比对得分从其达到的最大值降低量X;累积得分因一次或多次负分残基比对的累积而变成0或低于0;或到达任一序列的末端时，中断字命中点在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。化ASTN程序（对于核巧酸序列）使用如下默认参数:字长(W)是11，并且期望值(E)是10,并且化0SUM62计分矩阵（参看化nikoff和化nikoff,《美国国家科学院院刊》89:10915a989))比对(B)是50，预期值化)是10，M=5，N=-4，并且比较两条链。[0131]在某些实施例中，"序列一致性百分比"通过在至少20个位置的比较窗口比较两个最优比对序列确定，其中比较窗口中的多核巧酸序列部分与用于两个序列的最优比对的参考序列（其不包含添加或缺失)相比可W包含20%或更少、通常5到15%或10到12%的添加或缺失（即，间隙）。百分比通过W下方式计算:确定两个序列中存在的一致核酸碱基的位置数得到匹配位置数，将匹配位置数除W参考序列中的总位置数（即，窗口大小），并且将结果乘WlOO得到序列一致性百分比。[0132]本领域的普通技术人员应了解，作为遗传密码简并的结果，存在许多编码如本文所述的TCR的核巧酸序列。运些多核巧酸中的一些与编码结合到例如相同抗原的经修饰的TCR的天然或初始多核巧酸序列的核巧酸序列具有最小序列一致性。尽管如此，本发明明确地涵盖由于密码子使用差异而改变的多核巧酸。在某些实施例中，具体涵盖已经经过密码子优化W用于哺乳动物表达的序列。[0133]用于克隆、DNA分离、扩增和纯化；用于设及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制核酸内切酶等的酶促反应的标准技术;和各种分离技术是本领域的技术人员已知并且通常利用的技术。多种标准技术描述于Sambrook等人（1989)《分子克隆(MolecularCloning)》,第二版，冷泉港实验室（ColdSpring化rborLaboratoiT),纽约普莱恩维尤（Plainview,New化'1〇;131113*13等人（1982)《分子克隆》，冷泉港实验室，纽约普莱恩维尤;￥11(编）（1993)《酶学方法》218,第I部分;Wu(编）（1979)《酶学方法》68;Wu等人(编）（1983)《酶学方法》100和101;Grossman和Moldave(编）《酶学方法》65;MiIler(编）（1972)《分子遗传学实验化xperimentsinMolecularGenetics)》，冷泉港实验室，纽约冷泉港（ColdSpringHarbor,NewYork);01d和Primrose(Igsi)《基因操纵原理（PrinciplesofGeneManipulation)》，加利福尼亚大学出版社（UniversityofCaliforniaPress),伯克利(Berkeley);Schleif和Wensink(1982W分子生物学实用方法（PracticalMethodsinMolecularBiology)》；Glover(编）（1985WDNA克隆（DNACloning)》第巧PII卷，I化出版社，英国牛津（Oxford，UK);Hames和Higgins(编）（1985パ核酸杂交（NucleicAcidHybridization)》，I化出版社，英国牛津；W及Setlow和HolIaender(1979)《基因工程：原理和方法（GeneticEngineering=PrinciplesandMethods)》，第1-4卷，普雷纳姆出版社(PlenumPress),纽约(NewYork)中。缩写和命名在使用时被视为本领域中标准的并且常用于专业杂志(例如本文引用的那些）中。[0134]核巧酸序列之间的同源性可W通过DNA杂交分析确定，其中双链DNA杂交体的稳定性与出现的碱基配对程度相关。高溫和/或低盐含量的条件降低杂交体的稳定性，并且可W改变W防止具有低于所选同源性程度的序列退火。举例来说，对于具有约55%G-C含量的序列，40-50°C、6XSSC(氯化钢/巧樣酸钢缓冲液)和0.1%SDS(十二烷基硫酸钢)的杂交和洗涂条件指示约60-70%同源性，50-65°C、1XSSC和0.1%SDS的杂交和洗涂条件指示约82-97%同源性，并且52°C、0.1XSSC和0.1%SDS的杂交和洗涂条件指示约99-100%同源性。广泛范围的用于比较核巧酸和氨基酸序列（并且测量同源性程度）的计算机程序也是可用的，并且提供市售和自由软件的来源的清单见于Ausubel等人（1999)中。容易获得的序列比较和多序列比对算法分别是局部比对检索基本工具(BasicLocalAlig皿entSearchTool,BLASTKAltschul等人，1997)和ClustalW程序。BLAST在因特网上在ncbi.nlm.n化.gov可用并且Clus1:alW的版本在.ebi.ac.址可用。[0135]工业微生物菌株(例如，黑曲霉、无花果曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、里氏木霉、米黑毛霉、乳酸克鲁维酵母、己斯德毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽抱杆菌或地衣芽抱杆菌）、昆虫（果蛹）、哺乳动物（例如，中国仓鼠卵巢细胞系，CH0)或植物物种（例如，芥花、大豆、玉米、±豆、大麦、黑麦、小麦）可W用作用于重组产生TCR蛋白质的宿主细胞。在某些实施例中，高亲和力TCR蛋白质或可溶蛋白质的异源表达中的第一步骤，表达构筑体被组装W包括TCR或可溶TCR编码序列和控制序列，例如启动子、增强子和终止子。还可W包括其它序列，例如信号序列和可选标记。为了实现TCR的细胞外表达，表达构筑体可W包括分泌信号序列。在实施例中，如果需要细胞质表达，那么信号序列不包括于表达构筑体上。在实施例中，启动子和信号序列在宿主细胞中起作用并且提供TCR或可溶TCR蛋白质的表达和分泌。可W包括转录终止子W确保高效转录。增强表达或蛋白质纯化的辅助序列也可W包括于表达构筑体中。[0136]根据本发明可W使用各种启动子(转录起始调节区）。适当启动子的选择可W取决于所提议的表达宿主。来自异源来源的启动子只要其在所选宿主中起作用就可W使用。[0137]启动子选择还取决于肤或蛋白质产生的所要效率和水平。诱导型启动子（例如化C)通常用W显著增加大肠杆菌中的蛋白质表达水平。蛋白质的过度表达可能对宿主细胞有害。因此，宿主细胞生长可能受限。诱导型启动子系统的使用使得宿主细胞可在诱导基因表达之前培养到可接受密度，因此促进更高产物产率。[0138]根据本发明可W使用各种信号序列。可W使用与TCR编码序列同源的信号序列。或者，还可W使用已经被选择或设计用于在表达宿主中高效分泌和加工的信号序列。举例来说，适合信号序列/宿主细胞对包括用于在枯草芽抱杆菌中分泌的枯草芽抱杆菌sacB信号序列，和用于己斯德毕赤酵母分泌的酿酒酵母Q-交配因子或己斯德毕赤酵母酸性憐酸酶地Ol信号序列。信号序列可W通过编码信号肤酶裂解位点的序列直接连接到蛋白质编码序列，或通过由通常少于十个密码子组成的短核巧酸桥连接，其中桥确保下游TCR序列的正确阅读框架。[0139]已经针对真核蛋白质表达系统鉴别了用于增强转录和转译的元件。举例来说，将花挪菜花叶病毒(CaMV)启动子1000bp定位于异源启动子的任一侧上可W使植物细胞中的转录水平提高10到400倍。表达构筑体还应该包括适当转译起始序列。修饰表达构筑体W包括Kozak共有序列用于恰当转译起始可W使转译水平提高10倍。[0140]通常利用选择性标记，其可W是表达构筑体的一部分或从其分离(例如，由表达载体携载），使得标记可W整合于不同于相关基因的位点处。实例包括赋予抗生素抗性的标记(例如，对于大肠杆菌宿主细胞赋予氨节西林抗性的bla、赋予多种多样的原核和真核细胞W卡那霉素抗性的nptll)或允许宿主生长于基本培养基上的标记(例如，HIS4使得己斯德毕赤酵母或化S-酿酒酵母能够在不存在组氨酸的情况下生长）。可选标记具有其自身的转录和转译起始和终止调节区W使得标记可独立表达。如果抗生素抗性用作标记，那么用于选择的抗生素的浓度将取决于抗生素而变化，通常范围介于10到60化g抗生素/mL培养基。[0141]表达构筑体通过利用已知重组DNA技术(Sambrook等人，1989;Ausubel等人，1999)组装。限制酶消化和连接是用W连接DNA的两个片段的基本步骤。DNA片段的末端可能需要在连接之前修饰，并且运可W通过填充突出端、用核酸酶(例如，ExoIII)使片段的末端部分缺失、定点诱变或通过PCR添加新碱基对来实现。多连接子和衔接子可W用W促进所选片段的连接。表达构筑体典型地在利用大肠杆菌的多轮限制、连接和转化的各阶段中组装。众多适用于构筑表达构筑体的克隆载体在本领域中已知UZAP和pBLUESCRIPTSK-I，Stratagene,加利福尼亚州拉荷亚(；LaJolIa,CA);祀T,NovagenInc威斯康星州麦迪逊-引用于Ausubel等人，1999中）并且特定选择对于本发明并不重要。克隆载体的选择将受经选择用于将表达构筑体引入宿主细胞中的基因转移系统影响。在每一阶段结束时，所得构筑体可W通过限制、DNA序列、杂交和PCR分析来分析。[0142]表达构筑体可W转化到宿主中作为线性或环状的克隆载体构筑体，或可W从克隆载体移出并且按原样使用或引入到递送载体上。递送载体促进所选宿主细胞类型中表达构筑体的引入和维持。表达构筑体通过多种已知基因转移系统中的任一种（例如，天然感受态、化学介导的转化、原生质体转化、电穿孔、生物弹射击转化、转染或结合）引入宿主细胞中(Ausubel等人，1999;Sambrook等人，1989)。基因转移系统取决于所用的宿主细胞和载体系统而选择。[0143]举例来说，表达构筑体可W通过原生质体转化或电穿孔而引入酿酒酵母细胞中。酿酒酵母的电穿孔容易实现，并且产生与原生质球转化相当的转化效率。[0144]在除配位体结合部位W外的位点处与TCR蛋白质特异性地反应的单克隆或多克隆、优选单克隆抗体可W通过本领域中已知的方法制备，并且许多是市售的。参看例如化rlow和Lane(1988)《抗体：实验室手册（Antibodies:ALaboratoiTManual)》，冷泉港实验室；Goding(1986)《单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)》，第2版，学术出版社(AcademicPress),纽约；和Ausubel等人（1999)《最新分子生物学实验方法汇编（CurrentProtocolsinMolecularBiology)》，约翰?威利父子公司（JohnWiley&Sons,Inc.),纽约。[0145]对特定标祀配位体具有特异性的呈细胞结合或可溶形式的TCR适用作例如用于筛选生物样品（例如细胞、组织样品、活检物质、体液等)或用于检测测试样品中标祀配位体的存在的诊断探针。TC則寸常通过共价或非共价连接提供可检测信号的物质而标记。适合标记包括(但不限于)放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、巧光剂、化学发光剂、磁性粒子等。另外，TCR可W偶合到针对第二结合分子的配位体:举例来说，TCR可W经生物素化。结合到标祀细胞或分子的TCR的检测然后可W通过结合可检测抗生蛋白链菌素（巧光、放射性、化学发光或其它可检测分子连接的抗生蛋白链菌素，或其中存在发色底物的酶可用于的抗生蛋白链菌素)来实现。描述待共价结合到scTCR的此类标记和/或毒性化合物的使用的美国专利包括(但不限于)第3,817,837号、第3,850,752号、第3,927，193号、第3,939,350号、第3，996，345号、第4，277，437号、第4，275，149号、第4，331，647号、第4，：348，376号、第4，361，544号、第4,468,457号、第4,444,744号、第4,640,561号、第4,366,241号、第RE35,500号、第5,299,253号、第5,101,827号、第5,059,413号。[0146]经标记的TCR可W使用对于所使用的标记适当的监测装置或方法检测。可W使用巧光显微术或巧光激活细胞分选术，其中标记是巧光部分，并且在标记是放射性核素时，可W使用例如T计数、放射自显影或液体闪烁计数，限制条件为所述方法对于要分析的样品和所用的放射性核素是适当的。另外，可W利用二级检测分子或粒子，其中存在识别TCR的部分的可检测分子或粒子，所述部分在不存在如本文提到的MHC组分的情况下不是标祀配位体的结合位点的一部分。本领域知晓适用于原位诊断成像的化合物;参看例如美国专利第5，101，827号、第5,059,413号。适用于体内疗法和/或成像的放射性核素包括111铜、97钢、US舰、1"舰、I23舰、67嫁、99得。毒素包括尤其白喉毒素、藍麻毒素和藍麻子毒素，限制条件为在TCR-毒素复合物结合到细胞后，毒性部分内化，使得其可W发挥其细胞毒性作用。免疫毒素技术为本领域所熟知，并且适合毒性分子包括(但不限于)化学治疗药物，例如长春地辛(Vindesine)、抗叶酸剂（例如甲氨蝶岭）、顺销（Cisplatin)、丝裂霉素、蔥环霉素(anthrocycline)(例如道诺霉素（daunomycin)、道诺比星（daunorubicin)或阿霉素(adriamycin));和细胞毒性蛋白质，例如核糖体失活蛋白质，例如，白喉毒素、美洲商陆抗病毒蛋白质、相思豆毒素、藍麻毒素、假单胞菌外毒素A或其重组衍生物。一般来说，参看例如Olsnes和Pihl(1982)《药物疗法(Pharmac.Ilier.)》25:355-381;和《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy)》，Baldwin和Byers编，第159-179页，学术出版社，1985。[0147]已经公开了TCR分子的通式结构W及制备和使用(包括结合到肤:主要组织相容性复合物)方法。参看例如PCT/US98/04274、PCT/US98/20263、W099/60120。[0148]医药组合物和治疗剂[0149]对特定标祀配位体具有特异性的TCR适用于治疗被认为罹患与特定抗原相关的疾病(例如，寶生性疾病或病症，例如癌症）的动物和哺乳动物，包括人类。可W根据本文所述的方法治疗的癌症的类型的实例包括(但不限于)维尔姆斯氏肿瘤(Wilms't皿or)、膀脫癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋己瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、膜脏癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、小细胞肺癌和睾丸癌。[0150]治疗产品可W使用本文展示的物质制备。治疗产品的有效量是在受试者中产生可测量效果的最小剂量。治疗产品容易由本领域的普通技术人员制备。在一个实施例中，本发明的TCR直接投与到患者。在一个实施例中，本发明的TCR连接到阳G或免疫球蛋白恒定区，如本领域中已知。此实施例延长了血清清除。在一个实施例中，TCR连接到化学治疗剂或药物W便将药物递送到标祀细胞，例如癌细胞。在一个实施例中，TCR连接到生物效应分子，例如细胞因子(Tayal和Kalra(2008)《欧洲药理学杂志化urJ陆3^113。〇1)》，579，1-12)。在一个实施例中，TCRW抗肿瘤活性连接到细胞因子，例如化-2、化-12或TNFa(Wong等人(2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24,373-83)。在一个实施例中，TCR连接到免疫抑制性细胞因子，例如IL-IO或IL-13(Stone等人(2012)《蛋白质工程》）。在一个实施例中，TCR连接到另一抗原结合分子W形成双特异性药剂(Miller等人（2010)《蛋白质工程、设计与选择》，23，549-57;lliakur和Lum(2010)《分子治疗学当前观点（CurrOpinMol化6')》，12,340-9)。在一个实施例中，双特异性分子由TCR连接到单链Fv(例如抗CD3)组成(Bargou等人(2008)《科学》，321，974-7;Liddy等人(2012)《自然?医学》，18，980-7)，W交联T细胞和病变细胞。在一个实施例中，TCR连接到TCR信号传导域（例如CD3)W形成嵌合抗原受体（Porter等人(2011)《新英格兰医学杂志(N^iglJMed)》，365,725-33;Sadelain等人(2009)《免疫学当前观点》，21，215-23;Stroncek等人（2012)《转化医学杂志（JIYanslMed)》，10，48)。投药的运些方法和其它方法(例如静脉内）在本领域中已知。适用剂量可W由本领域的普通技术人员确定。[0151]TCR组合物可W通过本领域中已知的任何方式调配。其典型地可W制备为可注射剂，尤其用于静脉内、腹膜内或滑膜投药(途径由特定疾病决定）；或调配物，用于鼻内或口服投药，呈液体溶液或悬浮液形式。还可W制备适用于在注射或其它投药之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂还可W例如经乳化，或蛋白质/肤封装于脂质体中。[0152]活性成分通常与任选的医药添加剂(例如赋形剂或载剂)混合，所述医药添加剂是医药学上可接受的并且与活性成分相容。适合赋形剂包括(但不限于）水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其组合。scTCR于可注射剂、气雾剂或经鼻调配物中的浓度通常在0.05到5mg/ml范围内。特定有效剂量的选择是已知的并且由本领域的普通技术人员在无过度实验的情况下进行。类似剂量可W投与到其它粘膜表面。[0153]另外，必要时，可W包括scTCR的疫苗可W含有微量的医药添加剂，例如辅助物质，例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。可能有效的佐剂的实例包括(但不限于）：氨氧化侣;N-乙酷基-胞壁酷基-心苏氨酷基-D异谷氨酷胺（thr-MDP);N-乙酷基-正-胞壁酷基-1^-丙氨酷基-D-异谷氨酷胺(CGP11637,称为nor-MDP);N-乙酷基胞壁酷基-心丙氨酷基-D-异谷氨酷胺酷基-k丙氨酸-2-(1'-2二栋桐酷基-Sn-甘油-3?基憐酷氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-阳）；和RIBI，其在2%角整締/T识e班@80乳液中含有S种从细菌提取的组分:单憐酷脂质A、二霉菌酸海藻糖和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。还可W使用如本领域中已知的此类额外调配物和投药模式。[0154]本发明的TCR和/或具有与TCR可变区类似(大于90%-致性)的一级结构并且维持对于标祀配位体的高亲和力的结合片段可W调配成中性或盐形式的疫苗。医药学上可接受的盐包括(但不限于)用无机酸(例如，盐酸或憐酸)和有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸或马来酸)形成的酸加成盐（用肤的游离氨基形成）。用游离簇基形成的盐也可W来源于无机碱，例如，钢、钟、锭、巧或铁氨氧化物;和有机碱，例如，异丙胺、=甲胺、2-乙基氨基-乙醇、组氨酸和普鲁卡因（procaine)。[0155]用于治疗用途的TCRW与剂量调配物相容的方式投与，并且根据本领域已知的内容，其量和方式例如是预防和/或治疗有效的。待投与的量，其通常在每剂量约100到20，000yg蛋白质范围内，更通常在每剂量约1000到l〇,〇〇〇yg蛋白质范围内。类似组合物可W使用经标记的TCRW类似方式投与W用于成像，W便例如检测标祀配位体所结合的细胞。所需投与的活性成分的确切量可W取决于医生或兽医的判断，并且可W为每个个体所特有，但此类确定在此类执业医生的技能范围内。[0156]TCR产物可W在单一剂量中；在二剂量时程(例如间隔二到八周）中；或在多剂量时程中给出。多剂量时程是其中主要治疗过程可W包括1到10个或更多个单独剂量、接着是视需要在后续时间间隔投与W维持和/或加强反应的其它剂量的时程。[0157]除非另外陈述，否则所描述或例示的组分的每种调配物或组合可W用W实践本发明。物质的具体名称预期是例示性的，因为已知本领域的普通技术人员可W按不同方式命名相同物质。当在本文中描述化合物，方式为例如在化学式或化学名称中不规定化合物的特定异构体或对映异构体时，所述描述预期包括个别或W任何组合描述的化合物的每种异构体和对映异构体。本领域的普通技术人员将了解，除具体例示的那些W外的方法、标祀配位体、生物活性基团、起始物质和合成方法可W用于不借助于过度实验而实践本发明。任何此类方法、标祀配位体、生物活性基团、起始物质和合成方法的所有本领域已知的功能等效物预期包括于本发明中。每当在说明书中给出范围（例如溫度范围、时间范围或组成范围）时，所有中间范围和子范围W及所给出范围中所包括的所有个别值预期都包括于本发明中。[0158]确切配方、投药途径和剂量可W由个别医生鉴于患者的病况选择(参看例如Fingl等人，《治疗学的药理学基础（ThePharmacologicalBasisofHierapeutics)》，1975,第1章第顶）。[0159]应注意，主治医生会了解如何和何时因毒性或器官功能障碍而终止、中断或调整投药。反之，主治医生还会了解在临床反应不充足(排除毒性)时将治疗调整到更高水平。处理所关注病症时的投与剂量的量值将随待治疗的病况的严重程度和投药途径而变化。病况的严重程度可W例如部分通过标准预后评估方法评估。此外，剂量和可能剂量频率也将根据个别患者的年龄、体重和反应而变化。兽医学中也可W使用与上文论述的程序相当的程序。[0160]取决于所治疗的特定病况和所选的祀向方法，此类药剂可W经调配和全身或局部地投与。调配和投药的技术可W见于Alfonso和Gennaro(1995)中。适合途径可W包括例如口服、直肠、经皮、阴道、经粘膜或肠道投药;肠胃外递送，包括肌肉内、皮下或髓内注射，W及銷内、静脉内或腹膜内注射。[0161]对于注射，本发明的药剂可W于水溶液中，优选于生理学相容的缓冲液(例如汉克溶液化anks'solution)、林格氏溶液(Ringer'Ssolution)或生理盐水缓冲液）中调配。对于经粘膜投药，在调配物中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的。[0162]医药学上可接受的载剂用W将本文公开用于实践本发明的化合物调配成适用于全身性投药的剂量的用途属于本发明的范围内。通过恰当选择载剂和适合制造实践，本发明的组合物、尤其调配成溶液的组合物可W在肠胃外，例如通过静脉内注射而投与。适当化合物可W容易使用本领域中熟知的医药学上可接受的载剂调配成适用于口服投药的剂量。此类载剂使本发明的化合物能调配成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于由待治疗的患者口服摄取。[0163]预期细胞内投与的药剂可W使用本领域的普通技术人员熟知的技术投与。举例来说，此类药剂可W封装到脂质体中，并且然后如上文所述投与。脂质体是具有水性内部的球形脂质双层。在脂质体形成时存在于水溶液中的所有分子都并入水性内部中。脂质体内含物受外部微环境保护，并且因为脂质体与细胞膜融合，所W被高效递送到细胞的细胞质中。另外，由于其疏水性，因此小有机分子可W直接细胞内投与。[0164]适用于本发明中的医药组合物包括其中活性成分W有效实现预期目的量包含在内的组合物。有效量的确定完全在本领域的技术人员的能力范围内，尤其根据本文所提供的详细公开内容。[0165]除了活性成分之外，运些医药组合物可W含有有助于将活性化合物加工成可W在医药学上使用的制剂的适合医药学上可接受的载剂，包含赋形剂和助剂。经调配用于口服投药的制剂可W呈片剂、糖衣药丸、胶囊或溶液形式，包括经调配用于延迟释放或仅在药物到达小肠或大肠时释放的制剂。[0166]本发明的医药组合物可W按本身已知的方式制造，例如，借助于常规混合、溶解、粒化、糖衣药丸制备、悬浮、乳化、封装、包覆或冻干工艺。[0167]用于肠胃外投药的医药调配物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可W制备成适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，例如芝麻油;或合成脂肪酸醋，例如油酸乙醋或甘油=醋;或脂质体。水性注射悬浮液可W含有增加悬浮液粘度的物质，例如簇甲基纤维素钢、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可W含有适合的稳定剂或提高化合物的溶解度W允许制备高度浓缩溶液的试剂。[0168]用于口服用途的医药制剂可W通过W下方式获得:将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，和在必要时添加适合助剂之后，加工颗粒的混合物，获得片剂或糖衣药丸忍。具体来说，适合的赋形剂是填充剂，例如糖，包括乳糖、薦糖、甘露糖醇或山梨糖醇;纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、上豆淀粉、明胶、黄著胶、甲基纤维素、径丙基甲基纤维素、簇甲基纤维素钢和/或聚乙締化咯烧酬(PVP)。必要时，可W添加崩解剂，例如交联聚乙締化咯烧酬、琼脂或海藻酸或其盐(例如海藻酸钢）。[0169]糖衣药丸忍具有适合包衣。出于此目的，可W使用浓缩糖溶液，其可W任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙締化咯烧酬、卡波莫凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化铁、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可W添加到片剂或糖衣药丸包衣中W鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。[0170]可W经口使用的医药制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsule)W及由明胶和例如甘油或山梨糖醇的塑化剂制成的软密封胶囊。配合插入胶囊可W含有活性成分与例如乳糖的填充剂、例如淀粉的粘合剂和/或例如滑石或硬脂酸儀的润滑剂W及任选的稳定剂的混杂物。在软胶囊中，活性化合物可W溶解或悬浮于适合液体(例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇）中。另外，可W添加稳定剂。[0171]治疗方法[0172]高亲和力TCR和包含高亲和力TCR的医药组合物可W用W例如治疗患有癌症、月中瘤、恶性肿瘤或寶生性疾病或病症的患者。在一个实施例中，治疗患有癌症的患者的方法包含投与本文所述的高亲和力TCR。在另一实施例中，高亲和力TCR对存活素具有特异性。在一个实施例中，TCR包括包含SEQIDNO:1中阐述的氨基酸序列的Va。在另一实施例中，TCR包括包含SEQIDNO:2中阐述的氨基酸序列的Va。在一个实施例中，高亲和力TCR是包含SEQIDN0:3中阐述的氨基酸序列的单链TCR。在另一实施例中，高亲和力TCR是包含SEQIDNO:4中阐述的氨基酸序列的单链TCR。在另一实施例中，高亲和力TCR与治疗剂(例如，化学治疗剂)组合投与。在又一实施例中，高亲和力TCR结合到生物活性基团。[0173]本发明的另一方面提供了一种用于将T细胞过继转移到有需要的患者的方法，其包含投与表达本文所述的高亲和力TCR的T细胞。在一个实施例中，T细胞已经用编码对存活素具有特异性的高亲和力TCR的多核巧酸转染。在一个实施例中，TCR包括包含SEQIDNO:1中阐述的氨基酸序列的Va。在另一实施例中，TCR包括包含SEQIDN0:2中阐述的氨基酸序列的Va。在一个实施例中，高亲和力TCR是包含SEQIDNO:3中阐述的氨基酸序列的单链TCR。在一个实施例中，高亲和力TCR是包含SEQIDN0:4中阐述的氨基酸序列的单链TCR。[0174]实例[0175]W下实例进一步描述了本发明的非限制性实例。[017W实例1[0177]经工程化W获得对肤/HLA-A2抗原的更高亲和力的TCR[0178]用W发现或产生单链TCRW获得提高的亲和力和稳定性的通用策略展示于图1中。所述方法包括六个步骤，如所说明：[0179]1)将来自识别所关注的MH邱良制抗原肤的T细胞克隆的Va和VPTCR基因克隆成单链TCR形式W用于呈现。在本发明中，将来自与存活素抗原反应性的一种人类T细胞克隆的TCR基因（来自DeloresSchendel,!"IiomasBlankenstein和WolfgangUckert;参看例如Leisegang等人(2010)《临床研究杂志(JClinInvest)》.120(11),3869)克隆为单链形式(W-连接子-Va)，并且引入酵母呈现载体中用于表达于酵母表面上。与存活素抗原反应性的野生型TCR的进一步描述参看US2012/0128704。[0180]2)针对具有抗W抗体的稳定化变异体，产生易错库和进行FACs或磁珠选择。因为单链Va和WTCR通常由于稳定化恒定区的失去而不稳定，所W产生易错诱变库W针对使得可稳定表达于酵母表面上的稳定化突变选择，但可W使用其它呈现形式，包括(但不限于）隧菌体和哺乳动物呈现。隧菌体呈现载体和克隆产生了1〇11的库大小，而酵母呈现载体和同源重组步骤产生了l〇w的库大小(Benatuil等人(2010)《蛋白质工程、设计与选择》，23,155-9)。各种方法已经用于选择变异体，包括与固定化配位体的基于亲和力的结合（隧菌体呈现)或抗原情况下的磁粒选择(酵母呈现），或经标记的肤-MH讨亢原情况下的巧光激活细胞分选术(酵母呈现）。在本实例中，利用针对识别折叠表位的TCRVP的抗体，巧光激活细胞分选术(FACS)或磁珠选择用W分离具有改进的抗体结合的变异体。[0181]3)评估从易错库的选择中分离的scTCR克隆的热稳定性，并且针对亲和力成熟的模板，选择稳定化变异体，并且进行测序。典型地，鉴别促进增加的酵母表面水平和更大溶液稳定性的单一位点突变。[0182]4)将稳定化scTCR序列用作用于通常在CDRla、CDR3a、CDR3f3中产生CDR库的模板，但还可W使用其它区，包括(但不限于)CDRl0、CDR2a、CDR20和HV4。在本发明中，通过使用磁珠选择和/或巧光激活细胞分选术(FACS)，针对改进的与肤:MHC的结合从CDR库选择酵母呈现变异体，但可W使用利用其它方法的选择，包括(但不限于）隧菌体呈现情况下的淘选或哺乳动物呈现情况下的磁性选择或FACS。[01削5)评估从CDR库的选择中分离的scTCR克隆的与肤:MHC的特异性结合，所述scTCR克隆针对所述肤:MHC工程化。从酵母克隆捶救质体，并且对其测序。[0184]6)如果需要进一步的亲和力提高，那么步骤5中所选择的scTCR克隆可W用作用于在不选择突变的其它环或区（例如CDRla、CDR3a、CDR3f3)中产生额外库的模板，但还可W使用其它区，包括(但不限于)CDRie、CDR2a、CDR2f3和HV4。运些步骤中的每一个的实例进一步描述于下文中。[01化]实例2[01化]人类TCRA6的分析，其使用Va2,与化x:HLA.A2复合[0187]TCR都采用类似Ig折叠和对接角，并且P邱MHC的TCR识别完全由CDR环上的特定残基介导(Garcia等人(2009)《自然?免疫学》，10，143-7;Marrack等人(2008)《免疫学年鉴》，26,171-203;Rudol地等人(2006)《免疫学年鉴》，24,419-66)。尽管存活素TCR的晶体结构在本发明提出时不可用，但展示了使用与存活素TCR相同的Va2域的A6:Tax肤:HLA-A2复合物(PDB:1A07)(Garboczi等人（1996)《自然》，384,134-141)。复合物的侧视图显示，含有六个CDR的可变域的末端对接到化x:HLA.A2分子上，结合位点的中屯、区定位于肤化X上（图2A)。晶体结构不包括恒定区a,但恒定区有助于使全长构筑体稳定化。上文所述的在步骤2中选择的稳定化突变通常在框架区中选择，例如va/ve相间或化/Va或邱/ve相间的接合点在全长TCR中的存在处。[018引展示了除了六个CDR环W外，TCR"被去除"的^x=HLA.A2复合物的俯视图（图2B)。此图显示，TCR在肤-M肥上采用对角线位置，运是现在对于所有TCR:肤-M肥结构都观察到的发现。在此方向上，两个CDR3环定位于肤上，而来自CDRl和CDR2环的各种残基主要与MHC分子的螺旋相互作用。出于步骤4和6中的亲和力成熟的目的，运些环通常被祀向用于产生亲和力成熟库，但可W使用其它区。[0189]实例3[0190]存活素TCR的酵母呈现[0191]为了针对提高的稳定性(步骤2)或提高的亲和力(步骤5)进行选择，有必要使用如下呈现系统，其中可W分别针对与识别构象表位的抗体或肤:MHC配位体的结合，[0192]筛选TCR突变体的库。S种呈现系统已经用于使TCR工程化W获得更高亲和力，并且可W用于此过程:酵母呈现、隧菌体呈现和T细胞(哺乳动物细胞)呈现。替代性呈现方法(例如核糖体、RNA、DNA和CIS呈现)也可能适用于此过程。在所有运些情况下，将对于抗原具有低亲和力的野生型TCR克隆到系统中，并且用作用于使TCR工程化W针对肤:MHC配位体具有增强的稳定性和亲和力的模板。运些系统中的任一种可W应用于此处描述的方法，其中单一TCR被用作具有增强的结合性质的TCR的库和选择的模板。[0193]在本实例中，酵母呈现被用作平台（图3)。存活素TCR被用作用于经由易错诱变使突变稳定化的模板，并且从选择中分离的稳定化克隆被用作亲和力成熟的模板。[0194]实例4[01M]稳定化存活素TCR，Surv-K2的易错库构筑和选择[0196]如先前所描述(Richman等人(2009)《分子生物学方法(MethodsMolBiol)》，504，323-350)利用获自协作者(称为存活素71)的存活素反应性TCR作为模板，产生存活素易错库。通过组合经线性化的PCT302载体、存活素易错PCR产物和感受态邸Y100酵母细胞，将人类存活素易错库引入酵母呈现载体中。通过在电穿孔之后接种限制稀释等分试样的酵母对所得库进行判断，并且其含有约8.25XIO6个独立克隆。针对与识别人类V的0、抗hV的OFITCIgG(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter))的抗体的结合，经由FACS根据表4选择库。[0197]表4.分选条件[019引[0[0200]使用热变性研究，我们鉴别了此抗体识别ve2〇上的折叠表位(数据未展示）。使用AlcxaFluor3M88山羊抗小鼠IgG(生命技术(XifeTechnologies))二级抗体扩增信号。[0201]在3次迭代分选期间，V的0阳性染色群体出现（图4A)。在第3次分选之后，分离被称为Surv-K2的克隆，其具有改进的V的0巧光（图4B)DSurvK2克隆被用作亲和力成熟的模板。[020。实例5[0203]具有增强的与存活素:HLA.A2、Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6的结合的两种存活素TCR的CDR3a库构筑和选择[0204]从易错PCR库的选择中分离的稳定化Surv-K2克隆被用作用于经由重叠延伸剪接(SOE)产生跨越5个残基的CDR3a库的模板。因此通过组合经线性化的PCT302载体、Surv-K2CDR30库PCR产物和感受态EBYlOO酵母细胞，将人类Surv-K2CDR3ascTCR库引入酵母呈现载体中。通过在电穿孔之后接种限制稀释等分试样的酵母对所得库进行判断，并且其含有约2.98XIO7个独立克隆。根据表5使用磁性柱连续S次并且使用FACS-次，对Surv-K2CDR3a库进行分选。[02化]表5.分选条件[0黑1[0207]在使用磁珠的两次分选之后，适中阳性染色群体开始出现（图5A)。在第四次分选之后分离克隆Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6DSurv-K2.4.1和SurvK2.4.6展示增强的与SurvT2M(LMLGEFLKL，沈QIDN0:5)/HLA-A2的结合（图5B)。[020引实例6[0209]高亲和力存活素TCR，Surv-K2.4.1的结合分析[0210]为了评估从CDR3a库的选择中分离的Surv-K2.4.1克隆的结合，将呈现511'乂-K2.4.1的酵母用SurvT2M(LMLGEFLKL，SEQIDNO:5)/HLA-A2单体在6.4nM、32nM、160nM、8(K)nM和化M下滴定，并且通过流式细胞术分析(图6A)。使用非线性回归分析将各值标准化，并且确定279±44.5nM的Kd,3pp(图6B)。[0211]实例7[0212]获得针对存活素抗原的提高的亲和力的TCR的序列分析[0213]测定稳定化scTCR克隆K2和从亲和力成熟库中分离的存活素特异性化2.4.1和K2.4.6)高亲和力单链变异体的序列。如图7中所示，来源于酵母呈现库的两种高亲和力克隆的CDR区中存在突变。图7中的加下划线的位置指示起因于针对稳定化突变的易错库选择的突变。框中的位置展示选自CDR库的亲和力增强性突变。[0214]实例8[0215]T细胞中的K2.4.ITCR的体夕慌性[0216]为了评估T细胞中的K2.4.ITCR的活性，将CD8T细胞从AAD转基因小鼠中分离。然后将运些T细胞用抗CD3/抗CD28珠子活化24小时。将T细胞用PMP71载体反转录转导，所述载体含有K2.4.ITCR的Va和0域连接到鼠类2CTCR的Ca和邱域（图8A)。为了证实K2.4.ITCR的表达，转导后48小时将T细胞用浓度是20nM的Sur^2M:HLA-A2四聚体染色（图8B)dK2.4.1转导的T细胞(黑色)展示与模拟转导的T细胞(灰色)相比增加的SurvT2M:HLA-A2结合，证实了高亲和力TCR的表面表达。然后将T细胞在1:化:T下与外源地负载有滴定浓度的存活素肤的T2细胞一起培育。表达K2.4.ITCR的T细胞在SurvT2M肤存在下活化并且当用称为WTl(RMFPNAPYL，SEQIDNO:14)的对照肤呈递时不活化，表明此TCR在CD8T细胞中是活性并且特异性的。脚7]实例9[0218]存活素、Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6TCR的治疗形式[0219]现在众所周知，较高亲和力TCR可W按各种形式用于祀向表达相应抗原的细胞。因此，显而易见的是，由上文展示的工程化策略产生的TCR可W按可溶形式使用或按TCR基因疗法形式用于过继T细胞疗法，如图9中所说明。[0。0]材料和方法[0。1]抗体、肤:HLA-A2、MACS和流式细胞术试剂[0222]用W检测酵母表面表达的抗体包括：抗HA表位标签（克隆HA.11;科文斯(Covance))、抗hV03FITC抗体（克隆CH92;贝克曼-库尔特（Beckman-Coulter))、抗hVe3.巧11'(：抗体(克隆8。10;赛默科技）、抗的的0抗体(克隆化1^.4;贝克曼-库尔特）、产生于我们的实验室的抗Va2单克隆抗体(数据未展示）、山羊抗小鼠IgMAPC(生命技术）、山羊抗小鼠IgGF(ab'）2AIexaFIuor货.647二级抗体（英杰）、抗生蛋白链菌素-藻红蛋白（SA:PE，BDPharmingen)和MACS微珠（MiltenylBiotec)。[0223]在宾州州立大学医学院（PennStateUniversityCollegeofMedicine)(美国宾夕法尼亚州赫胥（Hershey,PA,USA))的大分子核屯、设施（MacromolecularCoreFacility)，通过标准F-moc(N-(9-巧基）甲氧幾基）化学，合成结合到HLA-A2Su;rvT2M:LMLGEFLKL(SEQIDNO:5)错定残基2的肤（经从T到M的修饰W获得改进的HLA-A2结合）(Andersen等人，2001，《癌症研究（CancerResearch)》61,5964-5968)。对于FACS和流式细胞术分析，使用重组可溶二聚HLA-A2:Ig融合蛋白（BD?Dime巧）。另外，将通过在UV光存在下将UV可裂解肤换成另一HLA.A2限制肤产生的单体化A.A2-生物素试剂用于流式细胞术和MACS选择（Rodenko等人（2006)《自然实验手册（化tProtoc)》，l，1120-1132;Toebes等人(2006)《自然?医学》，12,246-251)。[0。4]SCTv于酵母呈现载体中的克隆和表达[02巧]使TCR可变区片段（scTv)表达于酵母呈现质体pCT302(Ve-l^-Va)中（Boder和Wittrup(2000)《酶学方法》，328，430-444)，所述质体含有允许生长于化P培养基中的半乳糖诱导性AGA2融合体。SCTv基因的诱导包括使经转化的邸YlOO酵母细胞在选择培养基中生长到生长停滞期，接着转移到含半乳糖的培养基。由金斯瑞(Genscript)(美国新泽西州皮斯卡塔威(Piscataway，NJ,USA))合成模板存活素WTl单链TCR基因，其在构筑体的Va2域中具有F49S突变(Aggen等人(2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24，361-372)。[0226]将存活素特异性TCR基因从CTL克隆（针对存活素的TCR基因，来自DeloresSchendel,ThomasBlankenstein和WoIfgangUckert;例如Leisegang等人（2010)《临床研究杂志》.120(11)，3869)中分离，由金斯瑞合成基因，克隆为单链形式(W-连接子-Va)，引入酵母呈现载体中用于表达于酵母表面上。SCTv由可变组成含有通过连接子区GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQIDNO:7)连接化OO等人（1992)《美国国家科学院院刊》，89，4759-4763;Weber等人(2005)《美国国家科学院院刊》，102,19033-19038;Aggen等人(2011)《蛋白质工程、设计与选择》，24,361-372)。将SCTv引入PCT302的Mie巧肋hoi限制位点中。[0227]b变SCTv酵母呈现库的产生、呈现和选择[0。引易错PCR用W产生随机突变，如先前所描述(Richman等人（2009)《分子免疫学》，46,902-916)。使用重叠延伸剪接（SOE)PCR产生一次跨越4-5个相邻密码子的CDRl和3库化OTton等人(1990)《生物技术》，8，528-535)。[0229]对于SurvCDR3a库，利用W下引物对产生PreSOEPCR产物：5'-GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT-3'（剪接化）（SEQIDNO:8)和5'-CACAGCGCACAGATAGGTAGC-3'(SEQIDNO:10)W及5'-CTGATTCAGCTACCTATCTGTGCGCTGTGNNSNNSNNSNNSNNSATGTTTGGCGATGGTACTCAGCTGGTTGTG-3'（SEQIDNO:11)和5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'（T7)(SEQID^:9)。对每个相应？'6506与17和剪接化一起进行50￡PCR。[0230]通过将易错或SOEPCR产物与Nhe巧日趾ol消化pCT302-起电穿孔，通过在EBYlOO酵母中同源重组来制备酵母库化Odon等人(1990)《生物技术》，8,528-535)。将库于含半乳糖的培养基(SG-CAA)中诱导48小时，用ImL1%PBS/BSA洗涂，并且用抗体或肤:MHC试剂W图4A、5A、6A、8A和9A中指示的浓度染色。洗涂（Iml，1%PBS/BSA)细胞，并且使用FACSAria(碧迪生物科学（BDBioscience))高速分选仪或经由MACSLS柱在Qua化oMACS?分离器(MiltenylBiotec)上选择大多数巧光细胞。为了测试经分离的克隆的热稳定性，在染色方案之前将酵母在高溫下培育30分钟(数据未展示）。[0231]高亲和力克隆的分离和染色[0232]在选择之后，通过接种限制稀释液分离库克隆。使群落扩增并且于含半乳糖的培养基（SG-CAA)中诱导48小时，用ImL1%PBS/BSA洗涂，并且用各种浓度的肤/HLA.A2DimerX、山羊抗小鼠IgGF(ab'）2AlexaFluor某647二级抗体或各种浓度的UV交换肤/HLA.A2、SA-阳染色。将细胞洗涂（Iml，1%PBS/BSA)，并且在AccuriC6流式细胞仪上进行分析。[0233]使用巧moprep?酵母质体MiniprepII(巧moResearch)回收质体，并且经由热休克转化到亚克隆Efficiency?DH5a?感受态细胞(英杰）中而将其引回大肠杆菌中。使大肠杆菌细胞扩增，并且使用QIApr邱SpinMiniprep试剂盒(凯杰(Qiagen))分离质体。通过桑格测序(Sangersequencing)对个别克隆的序列进行测定。[0234]关于W引用的方式并入和变化形式的声明[0235]本文引用的所有参考文献，例如包括已颁发或授予的专利或等效物的专利文件；专利申请案公开;和非专利文献文件或其它原始材料，特此W全文引用的方式并入本文中，如同个别地W引用的方式并入一般，其程度使得每个参考文献至少部分不会与本申请中的公开内容不一致(例如，将部分不一致的参考文献除了参考文献的部分不一致部分W外W引用的方式并入）。[0236]本说明书中提及的所有专利和公开都指示本发明所属领域的技术人员的技能水平。本文引用的参考文献W全文引用的方式并入本文中，用W指示在一些情况下到其提交日为止的现有技术水平，并且预期在需要时此信息可W在本文中用W排除（例如，放弃)现有技术中的特定实施例或者使用现有技术水平中的方法或材料而不具体包括本文公开内容中的方法或材料。举例来说，当要求化合物时，应理解，现有技术中已知的化合物，包括本文所公开的参考文献(尤其参考的专利文件）中公开的某些化合物，并不打算包括于权利要求中。[0237]当在本文中使用马库什(Markush)群组或其它分组时，所述群组的所有个别成员W及所述群组的所有可能组合和子组合预期个别地包括于本发明中。[023引在本文中使用术语。包含（。0111口1'136/。0111口1'1363/。0111口1'136(1/。0111口1'13；[]1邑)"时，其欲解释为规定所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、组分或其群组的存在或添加。还预期涵盖如下的本发明的单独实施例，其中术语"包含(comp;rising/comp;rise(SVcomprised)"任选地替换成文法上类似的术语，例如"由……组成"或"基本上由……组成"，W便因此描述未必共同延伸的其它实施例。为清楚起见，如本文所用，"包會'与"具有"、"包巧'、"含嘗'或"特征为'同义，并且是包括性或开放性的并且不排除额外未列出的要素或方法步骤。如本文所用，"由……组成"排除权利要求要素中未规定的任何要素、步骤、组分或成分。如本文所用，"基本上由……组成"不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征(例如，不影响活性成分）的材料或步骤。在本文中各情况下，术语"包含"、"基本上由……组成"和"由……组成"中任一者可W替换成其它两个术语中的任一者。可W适合地在不存在本文未具体公开的任何要素、限制的情况下实践本文说明性地描述的公开内容。[0239]已经参考各种特定和优选实施例与技术来描述本发明。然而，应理解，在保持在本发明的精神和范围内的同时，可W进行许多变化和修改。本领域的普通技术人员将了解，除本文具体描述的那些W外的组合物、方法、装置、装置元件、材料、任选特征、程序和技术可W用于不借助于过度实验而实践如本文广泛公开的本发明。预期本发明涵盖本文所述的组合物、方法、装置、装置元件、材料、程序和技术的所有本领域已知的功能等效物;和其部分。每当公开范围时，预期涵盖所有子范围和个别值。本发明不受所公开的实施例限制，所述实施例包括图中展示或说明书中例示的任何实施例，其作为实例或说明给出并且不具限制性。本文提供的一些参考文献W引用的方式并入本文中，用W提供关于本发明的额外起始物质、额外合成方法和额外分析方法和额外用途的细节。[0240]本领域的技术人员将容易了解，本发明非常适于实施所提及的目标和获得所述目的和优势W及其中固有的那些。本文所述的如目前代表优选实施例的组合物W及方法和辅助方法是例示性的并且预期不为对本发明的范围的限制。本领域的技术人员将想到其中的变化和其它用途，所述变化和用途涵盖于本发明的精神内。[0241]参考文献[0242]1.AddoM.M.,DraenertR.,RathodA.,VerrillC.L.,DavisB.T.,GandhiR.T.,RobbinsG.K.,BasgozN.O.,StoneD.R.,CohenD.E.,JohnstonM.N.,FlynnT.,WurcelA.G.,RosenbergE.S.,AltfeldM.和Wa化erB.0.(2007)完全分化的HIV-I特异性CDSW效应细胞在受控制中比在进行性HIV-I感染中更频繁地检测到（FulIyDifferentiatedHIV-ISpecificCD8+TEffectorCellsAreMoreFrequentlyDetectableinControlledthaninProgressiveHlV-lInfection).《公共科学图书馆?综合(PLoS0肥）》2，e321。[0243]2.AggenD.H.,ChervinA.S.,InsaidooF.K.,PiepenbrinkK.,H.,BakerB.M.和KranzD.M.(2011)允许表达稳定单链T细胞受体的人类可变区的鉴别和工程化(Identificationandengineeringofhumanvariableregionsthatallowexpressionofstablesingle-chainTcellreceptors).《蛋白质工程、设计与选择(ProteinEngineering,Design,feSelection)》24,361-72。[0244]3.AnikeevaN.,MareevaT.,LiuW.和SykulevY.(2009)寡聚T细胞受体能否用作检测受感染细胞上的病毒肤表位的工具（CanoligomericT-cellreceptorbeusedasatooltodetectviralpeptideepitopesoninfectedcells)?《临床免疫学(ClinImmunol)))130,98-109〇[0245]4.ArmstrongK.M.,PiepenbrinkK.H?和BakerB.M.(2008)版-MHC复合物的构象变化和T细胞受体识别夷活性（ConformationalchangesandflexibilityinT-cellreceptorrecognitionofpeptide-MHCcomplexes)?《生物化学杂志（BiochemJ)M15,183-96。[0246]5.AshfieldR.和JakobsenB.K.(2006)制备高亲和力T细胞受体:一类新靴向治疗剂(Makinghigh-affinityT-cellreceptors:anewclassoftargetedtherapeutics).!Drugs9,554-9〇[0247]6.Bargou民.，LeoE.,ZugmaierG.,KlingerM.,GoebelerM.,KnopS.，Noppeney民.，ViardotA.，HessG.,SchulerM.,EinseleH.,BrandiC.,WolfA.，KirchingerP.,KlappersP.,SchmidtM.，民iethmulIerG.,ReinhardtC.,BaeuerleP.A.和KuferP.(2008)癌症患者的通过极化剂量的T细胞接合抗体的肿瘤消退（TumorregressionincancerpatientsbyverylowdosesofaTcell-engagingant化ody).《科学（Science)〉〉321，974-7。[024引T.BenatuilL.,PerezJ.M.，BelkJ?和HsiehC.M.(2010)-种改进的用于产生极大人类抗体库的酵母转化方法（Animprovedyeasttransformationmethodfor化egenerationofverylargehumanantibodylibraries).《蛋白质工程、设计与选择〉〉23，155-9。[0249]8.BirdR.E.,HardmanK.D.,JacobsonJ.W.,JohnsonS.,KaufmanB.M.,LeeS.M.，LeeT.,PopeS.H.,RiordanG.S?和WhitlowM.(1988)单链抗原结合蛋白质(Single-chainantigen-bindingproteins).((^4^))242,423-426〇[0巧0]g.BoderE.T?和Wittr叫K.D.(1997)用于筛选组合多版库的酵母表面呈现(Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries).《自然?生物技术(NatBiotechnol)〉〉15,553-557。[0巧1]10.BoderE.T.和WittrupK.D.(2000)用于蛋白质表达、亲和力和稳定性的定向进化的酵母表面呈现（Yeastsurfacedisplayfordirectedevolutionofproteine邱ression,affinity,andstability)?《酶学方法（MethodsEnzymol)〉〉328,430-44D[0巧2]11.BoonT?和OldL.J.(1997)癌症肿瘤抗原（Cancertumorantigens)?《免疫学当前观点（CurrOpinImmunol)〉〉9,681-3D[0253]12.BorbulevychO.Y.，San化anagopolanS.M.,HossainM?和BakerB.M.(2011)癌症基因疗法中所用的TCR经由不同机理与MART-l/Melan-A肿瘤抗原交叉反应(TCRsusedincancergenetherapycross-reactwithMA民T-l/Melan-Atumorantigensviadistinctmechanisms).《免疫学杂志（JImmunol)〉〉187,2453-63D[0巧4]13.BrowerV.(1997)Enbrel的III期加强了在RA中的展望[新闻]^nbrel'SphaseIIIreinforcesprospectsinRA[news]).《自然?生物技术〉〉15,1240。[0巧日]14.BulekA.M.,ColeD.K.,SkoweraA.,DoltonG.,GrasS.,MaduraF.,FullerA.,MilesJ.J.,GostickE.,PriceD.A.,DrijfhoutJ.W.,Knight民.民.，HuangG.C.,LissinN.,MolloyP.E.,WooldridgeL.,JakobsenB.K.，民ossJohnJ.，PeakmanM.，RizkallahP.J.和SewellA.K.(2012)在I型糖尿病中通过CD8(+)T细胞杀死人类目细胞的结构基石出(StructuralbasisforthekillingofhumanbetacellsbyCD8(+)Tcellsintypeldiabetes).《自然?免疫学（NatImmunol)〉〉13,283-9〇[0巧6]15.CheeverM.A.,AllisonJ.P.,FerrisA.S.,FinnO.J.,HastingsB.M.，HechtT.T.,MellmanI.,PrindivilleS.A.,VinerJ丄.，WeinerL.M.和MatrisianL.M.(2009)癌症抗原的优先排序：用于加速转译研究的国家癌症研究所样板工程（Theprioritizationofcancerantigens:anationalcancerinstitutepilotprojectforthe过cceler过tio打oftr过打si过tio打过Irese过rch).〈〇|各石开(^Cli打Csocer民es)〉〉15,5323-37。[0257]le.ChervinA.S.,AggenD.H.,RasemanJ.M?和KranzD.M.(2008)使用T细胞呈现系统使较高亲和力T细胞受体工程化（EngineeringhigheraffinityTcellreceptorsusingaTcelldisplaysystem).《免疫学方、法杂'志（JImmunolMethods)))339,175-84。[0258]17.QiervinAS，StoneJD，SotoCM，EngelsB，SchreiberH，RoyEJ和KranzDM.(2013)用^检查过继T细胞反应的具有多样结合性质的T细胞受体库的设计(DesignofT-cellreceptorlibrarieswithdiversebindingpropertiestoexamineadoptiveT-cellresponses)?《基因疗法（Gene11161^.)))20(6):634-440[0巧9]18.Co化yD.W.,KelloggB.A.,GraffC.P.,YeungY.A.，SwersJ.S?和WittrupK.D.(2004)通过酵母表面呈现使抗体亲和力工程化化ngineeringantiibodyaffinitybyyeastsurfacedisplay)?《酶学方法〉〉388,348-58〇[0260]19.DavisM.M.和BjorkmanP.J.(1988)T细胞抗原受体基因和T细胞识别(T-cellantigenreceptorgenesandT-cellrecognition).《自然〉〉334,395-402。[0261]20.DavisM.M.,BonifaceJ.J.,ReichZ.,LyonsD.,HamplJ.,ArdenB?和QiienY.(1998)通过a目T细胞受体的配位体识别(XigandrecognitionbyalphabetaTcellrec邱tors).《免疫学年鉴（AnnuRevImmunol)〉〉16,523-544〇[0262]21.DingY.H.,BakerB.M.,GarbocziD.N.,BiddisonW.E?和WileyD.C.(1999)产生极不同的T细胞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