专利名称：一种基于钌(ii)配合物的一氧化氮荧光探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及活细胞内一氧化氮的测定技术领域，具体地说是一种可用于活细胞内一氧化 氮荧光成像测定的钌(II)配合物荧光探针及其应用。
背景技术：
一氧化氮(N0)是一种高活性的顺磁性自由基分子，其反键p轨道上有一个未成对电子 ，在自然界中广泛存在。它能通过生物体自动合成并能在动物、植物、真菌、细菌体内与其 他一些自由基分子或金属蛋白快速反应，从而发挥重要的生理、病理作用。在生物体内，低 浓度的NO作为细胞内及细胞间一种信号传导分子在血液循环、免疫、神经系统中发挥重要的 作用(文献l: R. M. J. Palmer, A. G. Ferrige， S. Moncada， Naturel987， 327， 524;文献2: A. R. Butler， D. L. H. Williams, Chem. Soc. Rev. 1993， 22， 233;文献3: R. F. Furchgott， Angew. Chem. Int. Ed. 1999， 38， 1870;文献4:
L. J. Ignarro， Angew. Chem. Int. Ed. 1999， 38， 1882)，而当NO的浓度过高时，便与体内其他活 性氧物种(ROS)反应产生大量的活性氮物种(RNS)(文献5:
F. L. M. Ricciardolo, P. J. Sterk， B. Gaston, G. Folkerts， Physiol. Rev. 2004， 84， 731 )，进而 对核酸、脂肪以及蛋白质等生物分子造成损害。
由于N0具有非常重要的生理作用，建立灵敏的N0检测方法，特别是生物体系中的NO检测 方法越来越引起人们的关注。目前，NO检测主要有以下几种方法
(1) 利用NO是一种自由基特征的磁共振波谱法(文献6:
K. Sancier， G. Freeman, I. Mills, Science1962， 137， 752 ;文献7: T. Nagano, T. Yoshimura， Chem.Rev. 2002， 102， 1235)，但是，由于N0在液相中半衰期极短，极容易被氧化成其它氮氧 化物，使得该方法灵敏度、特异性、稳定性和应用范围上略有不足。
(2) 分光光度法，利用N0易被氧化成N02—，进而在酸性条件下与Griess试剂反应生成 重氮化物的方法(文献8:
L C. Green, D. A. Wagner, J. Glogowski， P. L Skipper, J. S. Wishnok, S. R. Tannenbaum， Anal. Bio chem. 1982， 126， 131)，该方法操作简单，但准确度、灵敏度较低。
(3) 电化学法，利用NO容易被氧化而发生电化学反应，从而对NO浓度进行测定的方法 (文献9: T. Maiinski，Z.Taha， Nature 1992， 358， 676 ;文献10:
F.Bedioui，N. Villeneuve，Electroanal. 2003,15,15)，该方法灵敏度高、电极稳定性好、使用寿命长，但可用于细胞内NO测定的电极制作困难，且将这种电极插入细胞会对细胞产生 较大的损伤。
(4) 化学发光法，用氧化剂将NO氧化成二氧化氮后利用激发态二氧化氮返回基态时释 放能量而发光的方法(文献ll: J. F. Brien， B. E. McLaughlin, K. Nakatsu， G. S. Marks, Methods Enzymol. 1996,268,83)，该方法灵敏度高，但是操作复杂，而且在操作过程中使用的氧化 剂如臭氧、过氧化氢等对细胞的损害很大，很难用于细胞体系中NO的测定。
(5) 使用特异性探针的荧光测定法(文献12:
H. Ko jima， N. Nakatsubo, K. Kikuchi， S. Kawahara， Y. Kirino， H. Nagoshi， Y. Hirata， T. Nagano, A nal. Chem. 1998， 70， 2446;文献13: M. H. Lim， D. Xu， S. J. Lippard， Nat. Chem. Biol. 2006， 2， 375 ;文献14: E.W.Miller，C.J.Chang，Curr.Opin.Chem. Biol. 2007， 11,620)，该方法具有操作 简单、灵敏度高、选择性好等特点，是目前最为理想的检测方法之一。但目前已有的NO荧光 探针所使用的荧光团都是有机荧光分子，这些有机荧光团存在光稳定性差、易被光漂白、pH 使用范围较窄、Stokes位移较小，易在测量时因激发和散射而发生荧光自淬灭等缺点(文献 15: Z.Zhang，S.Achilefu， Org. Lett. 2004,6,2067)。另外，虽然这些荧光探针分子能够穿 过细胞膜与细胞内的NO反应而产生荧光信号，但这些探针分子与NO的反应产物也很容易从细 胞中溢出，从而在荧光测定时产生误差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、选择性及水溶性好、适用范围广、可用 于活细胞内NO成像测定的钌(II)配合物荧光探针及应用。 本发明的技术方案如下
以联二吡啶及其衍生物为配体与二价钌形成的配合物，二 (2，2'-联二吡啶)(4-(3，4-二氨基苯氧基)-2，2'-联二吡啶)合钌(II)(以下简称Ru(bpy)2(dabpy)2,，为荧光探针 ，其中所述荧光探针结构式为Ru (bpy)2(dabpy)
所述基于钌(II)配合物的一氧化氮荧光探针的应用过程为在各类生物及非生物环境中 ，利用所述的钌(II)配合物荧光探针捕获体系中的NO，使得探针的荧光强度显著增强，然后 通过荧光测定法来确定NO的产生及生成量。所述荧光测定法包括常规的荧光测定法或荧光显 微镜成像测定法。
所述一氧化氮测定用钌(II)配合物荧光探针可用于含有其组份的测定试剂盒及相关试剂中。
本发明的荧光探针具有如下优点
1. 具有很好的水溶性，适用于细胞及生物组织等生物体系中一氧化氮的测定。
2. 稳定性高，能长期保存使用，适用于弱酸性、中性及碱性等多种环境。
3. 具有较高的NO测定灵敏度，最低检测下限为O. 27mmol/L。
4. 对NO有很好的选择性，与其他的活性氧物种作用时荧光信号几乎无变化。
5. 在氧气共存下可迅速与NO反应导致荧光强度增强，其荧光量子效率增大16. 9倍。
6. 在普通培养条件下即可进入活细胞内，特异性地与细胞内的一氧化氮反应，引起配合 物的荧光强度显著增强，进而用于活细胞中一氧化氮的荧光测定。
7. 探针与NO的反应的产物(以下简称Ru(bpy)2(T-bpy)2,不能穿过细胞膜而扩散到膜外 ，从而更加有利于细胞内NO的准确荧光测定。
图1是Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+和化(bpy) 2 (T-bpy) 2+的合成路线图。
图2是化0^7)2((1&5口7)2+ (实线，10mmol/L)和Ru(bpy)2(T-bpy)2+(虚线，10mmol/L)在 pH值7. 4的0. lmol/L磷酸缓冲溶液中的荧光光谱图。
图3是化0^7)2((1&5 7)2+ (B， 10mmol/L)和Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+(A， 10mmol/L)在不同pH 值的O. lmol/L磷酸缓冲溶液中的荧光强度变化图。
图4是Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+在pH值7. 4的0. lmol/L硼酸缓冲溶液中与各种活性氧物种反应产 物的荧光强度比较图。
图5是Ru(bpy)2(dabpy)2+与不同量N0饱和溶液在pH值7.4的0. lmol/L硼酸缓冲溶液中反应 后其产物荧光光谱的变化情况图。
图6是Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+在pH值7. 4的0. lmol/L硼酸缓冲溶液中检测NO的工作曲线图。 图7是Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+标记的小鼠巨噬细胞在无NO和有NO存在下的明场成像及荧光成
5像测定结果图。
图8是Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+标记的栀子细胞在不同培养时间下的明场成像及荧光成像测定 结果图。
图9是Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+与栀子细胞一起培养5小时后细胞的明场成像及荧光成像测定结 果图。
具体实施例方式
下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。本实施例仅用于对本发明进行 说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。
实施例l:配合物[Ru (bpy) 2 (dabpy) ] (PF6) 2和[Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+] (PF6) 2的合成 合成路线如图l所示，基体操作过程如下。
(1) 二 (2，2'-联二吡啶)(4-氯-2，2'-联二吡啶)合钌(II)(化合物l)的合成 将含有38. l毫克4-氯-2， 2'-联二吡啶(0. 2mmo1)和104. l毫克顺-二 (2， 2'-联二吡啶)
-二氯-二水合钌(II) (0.2mmo1)的60mL甲醇溶液加热回流6小时后蒸干，粗产品用硅胶柱 层析分离，用100:7:0. 5的CH3CN-H20-KN03溶液为洗脱剂。减压蒸出溶剂后产品用少量的 CH3CN-H20溶解后加入饱和六氟磷酸铵水溶液使配合物析出。过滤收集沉淀，并用少量水洗 涤，真空干燥后得目标化合物126.9毫克，产率71%。 ^NMR (CD3CN)测定结果 d=7. 37-7. 44(m， 6H)， 7. 63(d，
J (H， H) =6. 0Hz， 1H) ， 7. 69-7. 78 (m， 5H) ， 8. 0 (m， 5H) ， 8. 49 (d， J (H， H) =8. 0Hz， 5H) ， 8. 57 (d， J (H， H) =2. 0Hz， 1H) 。 ESI-MS (m/z) : 749. 1 ([M-PF6] +) ， 302. 0 ([M-2PF6] 2+)。
(2) 二(2，2'-联二吡啶)(4-(3-硝基-4-氨基苯氧基)-2，2'-联二吡啶)合钌(11)(化合 物2)的合成
在氮气保护下将38. 5毫克3-硝基-4-氨基苯酚(0.25mmo1) 、 IO毫克氢化钠(纯度60% ，0. 25mmol)在30mL干燥乙腈中常温搅拌45分钟后，加入89. 4毫克化合物1 (0. lmmol)，常 温搅拌过夜后减压蒸干溶剂。粗产品用硅胶柱层析分离，用100:7:0. 5的CH3CN-H20-KN03溶液 为洗脱剂。减压蒸出溶剂后产品用少量的CH3CN-H20溶解，加入饱和六氟磷酸铵水溶液使配 合物析出。过滤收集沉淀，并用少量水洗涤，真空干燥后得目标化合物91毫克，产率90% 。工HNMR (CD3CN)测定结果d=6. 66 (s， 2H， NH2) ， 6. 9 (m， 1H) ， 7. 10 (d， J (H， H) =9. 2Hz，1H) ， 7. 27 (m， 1H) ， 7. 34—7. 46 (m， 6H) ， 7. 73 (m， 4H) ， 7. 81 (d， J (H， H) =5. 2Hz， 1H) ， 7. 89 (d， J (H， H)= 2. 8Hz， 1H) ， 7. 97-8. 08 (m， 6H) ， 8. 40 (d， J (H， H) =8. 0Hz， 1H) ， 8. 47-8. 52 (m，鄉 ESI-MS (m/z) : 86 7. 2 ([M-PF6] +) ， 361 1 ([M-2PF6] 2+)。
(3) 配合物[Ru(bpy)2(dabpy)] (PF6)2的合成
向含有101. 2毫克化合物2的50mL乙醇溶液中加入50毫克的10。/。Pd/C催化剂，搅拌后加入 15微升水合肼并加热回流4小时。过滤除去催化剂，滤液减压蒸干。所得产品溶于少量的 CH3CN-H20后加入饱和六氟磷酸铵水溶液使配合物析出。过滤收集沉淀，并用少量水洗涤， 真空干燥后得目标化合物93. 3毫克，产率95%。 ^NMR (CD3CN)测定结果 d=6. 33 (m， 1H) ， 6. 42 (d， J (H， H) =2.他，1H) ， 6. 69 (d， J (H， H) =8.他，1H) ，6.81 (m， 1H) ， 7. 34-7. 4 5 (m， 6H) ， 7. 69-7. 76 (m，鄉，7. 81 (d， J (H， H) =5. 6Hz， 1H) ， 7. 99-8. 08 (m， 6H) ， 8. 35 (d， J (H， H) =8. OHz， 1H)， 8. 47(m， 4H) ESI-MS (m/z) :837. 1 ([M-PF6]+) ， 346. 1 ([M-2PF6] 2+)。元素分析结果 按C36H3()F^N80P2Ru计算值(％) : C44. 05， H3. 08， Nl 1. 41;实测值(％): C43. 81， H3. 42， N， 11. 27。
(4) 配合物[Ru(bpy)2(T-bpy)2+] ,2的合成
在外部冰-水浴冷却下将23毫克[Ru(bpy)2(dabpy)] (PF6)2 (0.024mmol)溶于20毫升的 2mol/L盐酸中。搅拌下加入3.2毫克亚硝酸钠的0. 5毫升水溶液，冰浴下搅拌2小时。反应液 用4mo 1 /L的氢氧化钠调至中性，蒸干后用硅胶柱层析分离，用100:10:1的CH3CN-H20-KN03溶 液为洗脱剂。减压蒸出溶剂后用产品少量的CH3CN-H20溶解，加入饱和六氟磷酸铵水溶液使 配合物析出。过滤收集沉淀，并用少量水洗涤，真空干燥后得目标化合物11.2毫克，产率 47%。工HNMR (CD3CN)测定结果d=6. 92 (m， 1H) ， 7. 27 (d， J (H， H) =8. 4Hz， 1H)， 7. 27-7. 48 (m， 5H)， 7. 51 (d，
J (H， H) =6. 4Hz， 1H) ， 7. 72 (m， 5H) ， 7. 85 (d， J (H， H) =5. 2Hz， 1H) ， 7. 95-8. 09 (m， 7H) ， 8. 35 (d， J (H， H )=8. 0Hz， 1H)， 8. 47-8. 51 (m， 4H) ESI-MS (m/z) :848. 1 ([M-PF6]+) ， 351. 4 ([M-2PF6] 2+)。元素分 析结果按C36H27F^N90P2RU计算值(％) : C43. 56， H2. 74， N12. 70;实测值(％): C43. 06， H3. 02， N， 12. 23。
实施例2:探针Ru (bpy) 2 (dabpy) ^及其与NO反应后产物Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+的性质测定 (1)光谱性质用pH值为7.4的0. lmol/L硼酸缓冲溶液作为溶剂测定了配合物的紫外可见光谱、荧光光 谱、摩尔消光系数(e)及荧光量子收率(f)。紫外可见光谱测定用仪器为Perkin Elmer Lambda 35型分光光度计，荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计，荧光量子 产率使用三(2，2'-联二吡啶)合钌(II)配合物作为标准物用文献方法测得(文献16: K. Nakamaru， Bull. Chem. Soc. Jpn. 1982， 55， 2697)。测定结果见表l。
表l. Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+及化(bpy) 2 (T-bpy) 2+在硼酸缓冲溶液中的吸收及荧光性质 化合物 最大吸收波长e455 nra 最大发光波长 f
(nm) (cm ^no1 、) (nm) (%)
Ru (bpy) 2 (dabpy)2+ 455 13000 610 0.13
Ru (bpy) 2 (T-bpy)2+ 455 9540 616 2.2
由表1可见，探针Ru(bpy)2(dabpy"+与N0反应前后其荧光量子产率发生了很大的变化， Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+的荧光量子产率只有0. 13%，而Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+的荧光量子产率达到了 2. 2%，表明探针Ru(bpy)2(dabpy)2+与N0反应后其量子产率增加了16. 9倍。两种化合物的荧光 光谱如图2所示。
(2) 溶液pH值对Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+及化(bpy) 2 (T-bpy) 2+荧光性质的影响 将配合物Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+及化(bpy) 2 (T-bpy) 2+用不同pH值的0. lmol/L的磷酸缓冲溶液
溶解后测定其在不同pH值下的荧光强度，结果见图3。由图可见，在pH值大于5的范围内，
Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+及化(bpy) 2 (T-bpy) 2+的荧光强度受pH值的影响不大，表明该探针在弱酸性
、中性和弱碱性环境中均可使用。
(3) 探针Ru (bpy) 2 (dabpy)"对NO测定的选捧性
分别考察了活性物种H202、 OH、 OC1—、单线态氧(1。2) 、 N02—、 N03—、 ONOO—、 02—以及 N0与探针Ru(bpy)2(dabpy)2+的反应情况，在相同浓度与反应条件(所有反应都在O. lmol/L的 pH值7.4的硼酸缓冲溶液中室温下进行，反应时间为l小时，反应浓度为Ru(bpy)2(dabpy)2+ :10mmol/L; H202: 100mmol/L H202; OH: lOOmmol/L H202+100mmol/L (NH4)2Fe(S04) 2; 0C1— :100mmol/L NaOCl; ^2: 100mmol/L H202+100 mmol/L NaOCl; N02—: lOOmmol/L NaN02; N03—: 100 mmol/L NaN03; 0N00—: 100mmol/L Na0N00; 02—: lOOmmol/L K02; NO: 40mmol/L )下9种活性物种与Ru(bpy)2(dabpy)2+反应产物的荧光强度测定结果如图4所示。由图可见， 探针Ru(bpy)2(dabpy)2+与H202、 0H、 0C1—、 ^2、 N02—、 N03—、 ONOO—、 02—反应后的荧光强度没有发生明显变化，表明Ru (bpy) 2 (dabpy) "+不与这些活性物种发生反应。当Ru (bpy) 2 (dabpy)" 与N0反应后，由于形成了强荧光性的Ru(bpy)2(T-bpy)2、导致探针的荧光强度显著增强。上 述结果表明探针Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+对N0测定具有很好的选择性。 实施例3:使用Ru (bpy) 2 (dabpy) ^测定水溶液中NO的浓度
在pH值为7.4的0. 111101/1^硼酸缓冲溶液中分别加入1^0^7)2((1&5口7)2+ (1Ommol/L)和不 同浓度的NO，搅拌反应O. 5小时后测定荧光强度。测定用仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分 光光度计。
如图5 (A)、图5 (B)所示，伴随着NO浓度的增加，探针的荧光强度也逐渐增加，表明 Ru(bpy)2(dabpy"+可用于定量测定溶液中生成的N0的浓度。图6给出了使用 Ru(bpy)2(dabpy)2+检测N0的工作曲线。如图所示，NO的浓度与荧光强度具有很好的线性关系 ，用本底信号标准偏差的3倍计算最低检出限为0. 27mmol/L，表明使用Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+定 量检测NO具有较高的灵敏度。
实施例4:探针Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+用于活细胞内NO的荧光成像测定 (1 ) Ru (bpy) 2 (dabpy)"标记的动物细胞中外源性NO的荧光成像测定
将新配制的[Ru (bpy) 2 (dabpy) ] (PF6) 2的DMS0溶液用DMEM培养基稀释成浓度为1. Ommol/L 的储备溶液(DMSO浓度为O. 1%)。用此溶液培养小鼠巨噬细胞，在5。/。C02培养箱中37。C下培 养5小时后，弃去培养液并用生理食盐水溶液充分洗涤细胞以除去未进入细胞的探针分子， 向培养瓶中加入含有1.0mmol/L的1-羟基-2-氧-3-(3-氨丙基)-3-甲基-1-三氮烯(简称NOC13 ，其在水溶液中可水解产生NO)的等渗盐溶液，在5。/。C02培养箱中37i:下培养0.5小时后进行 荧光成像测定。
图7给出了未加入NOC13和加入NOC13的细胞荧光成像图，由图可知，在没有加入NOC13时 ，Ru(bpy)2(dabpy"+标记的巨噬细胞几乎没有荧光，当加入NOC13后能明显观察到细胞发出 的荧光。通过对细胞的荧光强度分布情况进行分析，发现细胞质及细胞核处的荧光强度基本 相同，表明探针分子能够透过细胞膜进入细胞质并进入到细胞核中，进而对细胞内各处的NO 进行荧光显微成像测定。
(2 ) Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+标记的植物细胞中内源性NO的荧光成像测定
将培养中的栀子细胞过滤收集后加入到含有500mmol/L Ru (bpy) 2 (dabpy) 2+的等渗盐溶液中形成密度为每毫升3.5X10"细胞的悬浮液，在室温下振荡培养。每隔0.5小时取一定量的 细胞液在4。C下400rpm离心5分钟后，用等渗盐溶液充分洗涤除去未进入细胞的配合物，将洗 涤后的细胞置于载玻片上进行荧光成像测定。图8给出了不同培养时间下栀子细胞的荧光成像测定结果，由图可见，随着培养时间的 增加，细胞发出的荧光也明显增强，表明在培养过程中栀子细胞内可持续产生NO。通过对细 胞的荧光强度分布进行分析，发现细胞核区域的荧光强度要明显高于细胞质区域，说明植物 细胞内NO的生成发生在细胞核区域。使用同样的条件将Ru (bpy) 2 (T-bpy) 2+与栀子细胞一起培养5小时后进行荧光成像测定， 结果如图9所示。这时的细胞几乎无荧光发光，说明Ru(bpy)2(T-bpy)2+不能穿过细胞膜而进 入细胞内，也说明探针进入细胞后与N0反应生成的产物Ru(bpy)2(T-bpy"+不能穿过细胞膜而 扩散到培养液中，也不能在细胞洗涤过程中被洗出。10
权利要求
1.一种基于钌(II)配合物的一氧化氮荧光探针，其特征在于是以二价钌与联二吡啶及其衍生物形成的配合物，其中所述的配合物结构式为 id="icf0001" file="A2009103082590002C1.tif" wi="44" he="49" top= "39" left = "26" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2.权利要求l所述一氧化氮荧光探针的应用，其特征在于在各类生 物、微生物及非生物体系中，利用所述的钌(II)配合物荧光探针在含氧条件下与体系中的NO 特异性反应，使得探针的荧光发光显著增强，然后通过荧光测定法来确定NO的产生、生成量 及分布情况；所述荧光测定法包括常规的荧光分光光度计测定法或荧光显微镜成像测定法。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述一氧化氮测定用钌(II)配合物荧光探针用于含有其组份的测定试剂盒及相关试剂中。
全文摘要
本发明涉及一种可用于活细胞内一氧化氮成像测定的新型钌(II)配合物荧光探针及其应用。该探针是以钌(II)与联二吡啶及其衍生物形成的配合物，所述配合物的结构为右式，该配合物与活细胞共同培养即可进入活细胞内，进而特异性地俘获细胞内的一氧化氮，导致配合物的荧光强度显著增强，进而用于活细胞内一氧化氮的荧光成像测定。
文档编号C09K11/06GK101671555SQ200910308259
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月14日 优先权日2009年10月14日
发明者叶志强, 润 张, 王桂兰, 袁景利 申请人:大连理工大学