一种结晶型精酮合剂的制备方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结晶型精酮合剂的制备方法。
【背景技术】
[0003] L-精氨酸?a-酮戊二酸盐（AAKG)简称精酮合剂，是由L-精氨酸和a-酮戊二 酸络合形成的氨基酸盐，可以从溶液中以盐的形式结晶析出。在不同的结晶条件下，精酮 合剂可以形成单精氨酸酮戊二酸盐(MAAKG)和双精氨酸酮戊二酸盐（DAAKG)两种形式，目 前研究和应用较多的主要是单精氨酸酮戊二酸，其晶型为无色棱柱状，易溶于水，微溶于乙 醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能够完全解离为L-精氨酸和a-酮戊二酸。
[0004] L-精氨酸?a-酮戊二酸盐不仅兼具L-精氨酸和a-酮戊二酸的生理功能，且可 以作为功能性营养强化剂和护肝药物用于临床。L-精氨酸?a-酮戊二酸盐常用于保健品 原料、运动营养强化剂。L-精氨酸?a-酮戊二酸盐能够在短期内促进一氧化氮的水平，增 强蛋白质同化作用，因此能够增强力量并显著提高精力；增强体格，促进肌肉的快速增长和 创伤恢复；还能促进肝细胞对营养和能量的代谢，增强力量和精力。
[0005] 精酮合剂有1:1和2:1 (L-精氨酸：a-酮戊二酸）两种配比的盐，即单精氨酸酮 戊二酸盐和双精氨酸酮戊二酸盐，两种精酮合剂理化性质非常接近，但是在功能和应用领 域上有一定的差异。单精氨酸酮戊二酸盐（MAAKG)主要的作用是增加血液一氧化氮水平， 刺激血管舒张，促进训练后的肌肉生长，作为保健品、运动强壮剂在美国市场上很受青睐。 双精氨酸酮戊二酸盐（DAAKG)是一种拥有多种生理作用的有机酸盐，对肝硬化病人给予高 剂量的DAAKG，其肝脏脱毒功能得到增强，血浆氨、血清酚浓度得到显著降低，其氧化分解作 用得到增强。这种作用在治疗氨中毒或用于强化肝脏解毒功能的动物模型试验中也得到证 明，治疗组的存活率相对于控制组较高，而且较少出现昏迷。
[0006] 文献"由L-精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂，食品与发酵工程，2012年"公开了 一种L-精氨酸发酵液制备结晶型精酮合剂的方法，该方法直接从L-精氨酸发酵液进行制 备AAKG，将AAKG的生产有效的整合到L-精氨酸发酵产物的后提取过程中，从整体上缩短流 程，显著降低了生产成本；但是该方法产生了大量的废水，如何处理废水是亟待解决的技术 问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种结晶型精酮合剂的制备方法， 该方法将废液进行了有效处理，节能环保。为了实现本发明目的，采用如下技术方案： 为了实现本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 一种结晶型精酮合剂的制备方法，所述方法包括如下步骤： 步骤1):往L-精氨酸发酵液加入草酸沉淀Ca2+，再调节溶液为pH9. 5,用聚丙烯酰胺 对溶液进行絮凝，然后离心去除固形物，收集上层溶液；往上层溶液中加入活性炭，调节PH4. 8,脱色处理40min，最后离心得L-精氨酸清液； 步骤2):向步骤1)的L-精氨酸清液中缓慢加入a-酮戊二酸，搅拌使其完全溶解，减 压浓缩，然后缓慢降温，置于15°C下恒温结晶26h，待结晶完全后，分离晶体和一次目液，得 到粗产品AAKG; 步骤3):将步骤2)得到的粗产品AAKG晶体重新溶解，加入活性炭进行脱色，搅拌并将 溶液加热至80°C，维持40min，再通过板框过滤，收集AAKG滤液，重结晶，然后过滤收集晶体 和二次母液； 步骤4):合并一次母液和二次母液得到废液，调整废液的pH为7-7. 5,然后按照5g生 物制剂：1立方米废液的添加量添加生物制剂，再静置六天，排出。
[0008] 所述生物制剂按照如下方法制备而成： 步骤A)制备生物载体： (1) 按照重量份称取下述各原料备用，其中，水25份，褐煤10份，高岭土 8份，沸石粉6 份，甲壳素4份，硅胶粉1份；其中，沸石粉和硅胶粉的粒径均为200目，甲壳素的粒径为50 目； (2) 将褐煤用破碎机进行破碎，然后添加高岭土，混合均匀，研磨至100目的粉末，即为 物料1 ; (3) 向沸石粉中添加相同重量的1M氯化钙溶液，搅拌均匀，然后350°C焙烧3小时，得 到物料2 ; (4) 将水，物料1，物料2,甲壳素以及硅胶粉依次添加到搅拌反应器中，500转/min搅 拌lOmin，静置30min，然后200转/min搅拌3min，最后置于60°C烘干至水分含量为5%，即 得生物载体； 步骤B)制备生物制剂： 将枯草芽孢杆菌，鲍曼不动杆菌、巨大芽孢杆菌以及鞘氨醇单孢菌分别培养至浓度为 1X107个/ml的菌液，将斜生栅藻培养至浓度为1X105个/ml的藻液，将上述培养的枯草芽 孢杆菌液、巨大芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌液、鞘氨醇单孢菌液以及斜生栅藻液按照2 :2 :1 : 1 :1的体积比混合，静置6小时，得到混合液体；将混合液体与生物载体按照1 :2的质量比 混合搅拌均匀，室温发酵24h，干燥至含水量为10%，即得。
[0009] 所述巨大芽抱杆菌为（Bacillusmegatherium)CGMCCNo:2267,枯草芽抱杆菌为 (Bacillussubtilis)CGMCCN0: 2947,鲍曼不动杆菌为（Acinetobacterbaumanii)ATCC 19606,銷氛醇单抱菌为（Sphingomonassp. )CGMCCNO. 4589,斜生概藻为（Scenedesmus obliquus)CGMCCNo. 8015。
[0010] 本发明所述菌种和藻类均可以从保藏中心等商业途径购买得到。
[0011] 本发明所述的菌种和藻类均可通过常规的培养方法得到所需浓度的菌液或藻液， 此并非本发明的创新点，限于篇幅，并不一一赘述。
[0012] 本发明取得的有益效果主要包括： 本发明直接从L-精氨酸发酵液进行制备AAKG，将AAKG的生产有效的整合到L-精氨酸 发酵产物的后提取过程中，从整体上缩短流程，显著降低生产成本，整个过程废液得到了有 效处理，节能环保； 本发明处理发酵废液的方法简单可行，成本低廉，处理效果好；本发明提供的载体，采 用不同粒径的原料，不仅能够扩大载体的比表面积，而且具有抗拉强度大、分布均匀、比表 面积大，使用寿命长等特点；本发明提供的载体能够大大提高微生物的附着量，增加整体附 着的生物膜量，反应槽中的微生物浓度得以提高，并且能够减少污泥产生量；本发明载体提 供的厌氧、缺氧和好氧的多样环境的存在可以促进硝化反硝化效果，同时促进污泥的减量 化，有利于废液中氨氮等污染物的去除；本发明的生物制剂将各种能形成优势菌群的菌种 和藻类，配制成高效生物制剂，各微生物之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，生物量大，繁 殖快。
[0013] 本发明生物制剂适于发酵废液处理，便于运输及保存，使用时更容易激活，运行成 本低廉。
[0014] 实施例1 一种结晶型精酮合剂的制备方法，其包括如下步骤： 步骤1):将发酵制备的L-精氨酸发酵液5L，先加入100g草酸沉淀Ca2+，在55°C下加 热15min沉淀蛋白质；调节溶液pH9. 5,在30°C左右用聚丙稀酰胺（400mg/L)对发酵液进 行絮凝，然后离心去除菌体等固形物，收集上层溶液；往上层溶液中加入50g活性炭，调节 PH4. 8,加热至70°C进行脱色处理40min，最后经过离心得L-精氨酸清液4. 2L，经测定溶液 中L-精氨酸的含量59g/L，溶液中共含有L-精氨酸1. 42mol; 步骤2):向步骤1)的L-精氨酸清液中缓慢加入a-酮戊二酸固体粉末207g，搅拌 使其完全溶解，减压浓缩，获得浓缩液〇. 84L，按照一定的速率缓慢降温，置于15°C下恒温 结晶26h，待结晶完全后，分离晶体和一次母液，得到粗产品AAKG晶体342. 04g，收得率为 75. 3% ； 步骤3):将步骤（3)粗产品AAKG晶体340g重新溶解，加入适量的活性炭进行脱色，搅 拌并将溶液加热至80°C，维持40min，再通过板框过滤，收集AAKG