专利名称：抗原及配体pcr管式检测试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗原及配体的PCR管式检测试剂盒及其制备方法和应用，尤其是涉及一种通过PCR管组装成的可直接进行抗原及配体检测的试剂盒及其制备和应用。
背景技术：
早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础，抗体捕捉方法是简易方便的筛选方法。抗体捕捉法中，抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原，洗板去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体，许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体。例如，检测抗体是鼠抗体，检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体。传统的检测标记包括放射性同位素，染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。
抗原捕捉检测法是检测样品中有无抗原。首先抗体先结合到支持物上，然后抗原加入和抗体反应形成复合物，最后检测复合物。也可以抗原抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。
ELISA是广为人知的免疫检测法，1971年一问世，就启动了诊断方法的革命，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合到某一抗原。捕捉抗体同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的偶连酶的检测抗体反应形成捕捉抗体—抗原—检测抗体“三明治”复合物，最后测偶连酶活性显示检测结果。
抗体检测法具有较大的应用价值，但是他的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的Kd值限制，在实践中，检测底线大约是Kd值的1％，当待分析物浓度降低到这个可能检测限时，捕捉到待分析物抗体百分率不足以产生相对于信噪比的可检测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约1pg/ml(10-4M对平均分子量50,000道尔顿的蛋白质)随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检测技术。
核酸待测物的检测要求不同于抗体检测的技术。在二十世纪八十年代中期，DNA技术的研究发现了通过酶重复扩增过程可扩增DNA的方法，后来叫多聚酶链反应(PCR)首先加入两互补的寡核苷酸序列(叫引物)，它将结合在所要扩增的区域的两侧，然后加热变性，在降温退火让引物同互补序列结合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物。通过重复变性、退火、延伸所希望的片段，目标DNA就会以指数方式扩增。PCR曾经过许多改进，一个重要的变化是Tag聚合酶的应用，它产于温泉中嗜热菌，具有热稳定性，几乎不被PCR变性中高温影响，所以不必象应用不耐热的Klenow聚合酶I，每一次变性后得补加聚合酶。
以PCR作为扩增系统的运用中，产生了免疫-PCR方法，它是把特定待测物连接到微孔板上，然后用PCR扩增放大能力来检测，这个方法结果也不能定量。小牛血清白蛋白(BSA)被动吸附到一免疫检测板上，加入对BSA的特异抗体(连有蛋白A链亲和素融合蛋白及生物素标记的报告扩增子)，PCR后用琼脂糖电泳分析报告扩增子，可检测到几百个BSA分子。然而，这种方法不能用于生物样品检测因为缺乏待测物的特异捕捉分子。人们曾对该方法做了改进用生物素化第二抗体和一个连接生物素化报告扩增子的链亲和素融合蛋白。然而5种试剂的加入、洗板、扩增、检测很费事费力，而且解离复杂。所以产生了新的改进把报告扩增子共价连到第二抗体上，直接连接减少了试剂数目和解离复杂性，然而仍需要PCR操作，增加了劳动和试验室污染的可能性。
三明治式免疫-PCR是由传统ELISA方式的改编而来，即检测抗体连有DNA标记，再运用到分析检测生物样品，早期的抗体免疫-PCR检测形式初级抗体被固定在平板上，然后依次加入样品，再生物素化检测抗体，链亲和素和生物素化的DNA。后来改进为直接连接DNA到抗体上和用标记引物产生PCR产物，可ELISE检测分析代替凝胶电泳分析，PCR的扩增能力产生大量DNA标记，可以用各种方法检测如典型的凝胶电泳、染色分析。PCR扩增抗体携带的DNA标记可实现提高对抗原检测的灵敏度(该法缺少用基因芯片法来检测)。所以免疫-PCR技术已被用于检测多种待检物。虽然免疫-PCR提高了灵敏度，比传统ELISA方法的灵敏度还高，但用凝胶电泳纯化扩增产物需要大量人工操作，因此耗时，而且用于PCR扩增的引物在退火时可二聚体扩增产生副产品，另外，它污染核糖的存在或污染也将同样被扩增。
采用一个捕捉抗体，免疫PCR方法就类似于直接ELISA三明治夹心法，不同点在于选择检测方法。免疫-PCR方法已被成功用于检测，有的敏感度达attomol水平(包括检测下列物质肿瘤坏死因子、β-半乳糖甘酶、人甲状腺刺激激素、鼠可溶T-细胞受体、重组乙肝表面抗原、不同的人心钠素、β-葡糖苷激酶、绒毛膜促性腺激素)。
在免疫PCR中，抗原浓度通常由PCR后产物分析决定，可以是凝胶电泳分析，也可以是PCR-ELISA分析。定量分析PCR终点产物的DNA标记易产生错误结果，因为产物形成率在几个对数增长循环后即下降，再者PCR样品处理可致实验室污染。另外，这些实验需多步骤且需冲洗，这个过程中抗原抗体复合物可能解离。
实时定量PCR是更先进的PCR技术，已用于核酸分析。在实时PCR中，PCR扩增DNA是在非线性标记双荧光杂交探针存在条件下进行，其中一种荧光染料用作报告分子，它的发射光谱被第二种荧光染料淬灭。实时PCR在链延伸时，利用Taq多聚酶5’核酸活性切割杂交探针，结果使报告荧光染料从淬灭染料中释放出来，致报告分子发射峰值增加。整个反应实时监控。逆转录-PCR也可应用。系列检测系统用96孔热循环仪可连续检测每孔中PCR反应时的荧光谱，因此，可排除复制子试验室污染。
报告染料位于探针5’端(FAM)，淬灭染料位于3’端(TAMRA)，此探针和PCR扩增的特殊靶序列结合，当未结合时，5’端FAM发射的荧光被3’TAMRA淬灭，但随着PCR循环增加，扩增子增多，杂交探针被多聚酶5’-3’外切酶活性切割，报告染料就从淬灭染料上分离出来。序列检测系统用氩原子激光激活荧光(488nm)，激光装置照相机监控PCR反应，收集从所有96孔发出的500nm-660nm荧光。然后利用相应原理、设立内参照直接通过一定的软件分析定量。
核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象。核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要。通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。SELEX技术被用来分离所选靶目标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，SELEX技术就是利用该原理筛选靶分子配基的方法。
Gold等在1995年(Gold L，et al.Annu Rev Biochem，64763--797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且进行病情监测和疗效检验。Gold等又在1999年(Gold L，et al.Diagn Dec；4(4)381-8)在配基微阵分子诊断应用研究中，对配基微阵分辨率进行研究。均显出核酸配基检测有巨大的应用前景。但是目前的配基检测都是采用直接对配基PCR扩增放大检测的方法。这种方法操作复杂，需要将配体和配基分离，且灵敏度低(由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合阻断DNA复制)和准确性差。
SELEX技术开始后，许多靶标的核苷酸配基已被筛选出，尤其是已知能和核酸结合的许多蛋白质可作为SELEX技术的较合适靶标，如T4DNA聚合酶、噬菌体R17被膜蛋白，大肠杆菌rho因子，大肠杆菌核糖体蛋白S1，苯丙氨酸-tRNA合成酶，识别RNA的自身免疫抗体，E2F转录因子，不同的HIV相关蛋白。
SELEX技术可筛选出许多不同蛋白配基的事实引发了配基应用的拓展，可作为单抗和多抗产品的替代品应用于诊断和治疗。配基代替抗体应用于诊断已显示其价值。DNA聚合酶的配基已被用于热启动PCR来诊断低拷贝的复制子，提高PCR敏感性和保真性。配基也被用于促进实验方法。中性弹性蛋白的酶配体荧光标记后用于流式细胞仪检测弹性酶浓度，中性弹性蛋白酶配基尚用于鼠肺炎症诊断模型体内诊断。
在酶联寡核苷酸方法(ELDNA)中，一个或多个抗体被对抗原有高亲和力高特异性的配基取代。这样的配基可通过SELEX技术体外筛选获得，见美国专利WO96/40991和WD97/38134描述了酶联寡核苷酸方法，其中用核苷酸配基代替夹心法中的检测抗体或捕捉抗体。通常，夹心法用传统的酶联检测抗体检测捕捉分子-抗原复合物，然而用报告酶分子标记寡核苷酸，这需要化学合成步骤和额外的劳动。上述用抗体试剂的方法本身也存在着困难。
上两个专利中也提到捕捉分子-靶分子-检测分子复合物中核酸配基PCR扩增检测系统；利用常用报告分子如酶、生物素等的PCR引物来扩增扩增子，这样做是提高了配体的数量，但是也带来了不利需进一步把扩增的配基和不纯的核苷酸引物二聚体分离的步骤。传统的凝胶分离需大量人工劳作。DNA和RNA配基都存在着这样的问题。用标记的引物不能解决不纯问题和引物二聚体扩增问题，因此，无法定量。
尽管上述进步显著，但诊断方法仍需提高灵敏度，减少人工操作，改进动态监测以快速分析样品中靶标的存在与否及对其定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单的PCR管作为附着材料，附着捕捉靶分子的抗体或配基制成一种PCR管式抗原及配体检测试剂盒。同时，本发明的目的还在于提供一种检测试剂盒的制备方法和应用。
该试剂盒检测抗原及配体的方法是将与PCR管上包被的捕捉靶分子抗体或配基与待测靶分子的抗原或配体结合，再在其结合的复合物上链接带有标记的核酸分子及配基修饰序列的检测抗体或配基，通过对核酸分子或配基修饰序列进行PCR扩增，通过实时定量-PCR检测和寡核苷酸芯片检测即可完成对抗原及配体的检测。
本发明的目的可通过如下措施来实现一种抗原及配体PCR管式检测试剂盒，包括试剂盒；PCR管，设于试剂盒内，所述的PCR管是以经戊二醛处理的聚苯乙烯作为附着材料，在附着材料上包被捕捉靶分子的抗体或配基制成。
一种抗原及配体PCR管式检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤(1)用0.04-10％戊二醛，在温度为37℃下处理聚苯乙烯PCR管，1-3小时；(2)用三蒸水清洗PCR管三次，2-5分钟/次；(3)将捕捉靶分子的抗体或配基用PH9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上；(4)将包被有捕捉靶分子的抗体或配基的PCR管用含5％脱脂奶粉或甘氨酸、牛血清白蛋白、poly(dI.dC)或龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液封闭；(5)干燥，将封闭的PCR管装入试剂盒即可。
一种抗原及配体PCR管式检测试剂盒的应用。
一种利用抗原及配体PCR管式检测试剂盒的检测方法，该方法包括下述步骤(1)在包被有捕捉靶分子的抗体或配基的PCR管中，加入待测样品；在37℃，45分钟孵育，使PCR管上的捕捉靶分子的抗体或配基与待测样品中的靶分子的抗原或配体结合，形成复合物；(2)再在上述步骤(1)中形成的复合物中加入带有人为序列修饰的检测抗体或配基，使检测抗体或配基与PCR管上包被的捕捉靶分子的抗体或配基和结合的靶分子的抗原或配体形成“三明治”式结构；所述的人为修饰序列具有一对引物和中间的人为标记序列；(3)然后PCR扩增人为修饰序列；(4)用实时定量-PCR进行检测，或将修饰序列的互补序列制成微阵列与扩增后的修饰核酸序列(探针上带有标记物)杂交进行微阵列检测。
所述的步骤(4)中的实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。
所述的配体是指核酸、蛋白质、多肽、有机染料、ATP、金属离子类的任何分子。
所述的配基是指能与配体直接结合的特异寡核苷酸配基。
本发明相比现有技术具有如下优点本发明的检测剂盒是利用PCR管(聚苯乙烯等材料)经戊二醛等方法处理，可附着核酸配体(或抗原、抗体及配基等)，通过特异寡核苷酸配基(或携带信号分子的特异寡核苷酸配基)与配体直接结合，将配体信号转换成核酸配基信号，然后经PCR(或滚环复制)扩增放大、检测，来测定配体；该方法检测配体具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体微阵检测和可机械化完成等特点。
本发明是利用具有附着能力的PCR管(或经过戊二醛等化学物质处理后具有附着能力)；即PCR管本身具有附着能力或经过化学物质处理后具有附着能力，如聚苯乙稀PCR管经3.5％的戊二醛处理后，具有附着靶分子的能力。该PCR管具有机械加样，附着靶分子，孵育，洗管等，无须将靶分子分离提纯。
本发明是利用连接在抗体或配基上的人为修饰DNA或RNA序列作为信号分子，通过对信号修饰序列的PCR扩增，实现对抗原或配体的检测。该修饰DNA或RNA序列具有一对引物和中间的人为标记序列，针对被检测的靶分子和检测目的的要求这一对引物可以相同也可以不相同，中间的标记序列是靶分子的标记。如在多种样品同时检测时一对相同引物可以使多种样品检测数据更切合实际，标记序列则是和检测靶分子一一对应。
本发明的检测仪器可通过对DNA或RNA修饰序列的变换来达到数据的效正和有效的消除污染。
本发明的检测仪器是通过用实时定量-PCR仪进行扩增产物检测或寡核苷酸芯片检测来数据采集和处理。便于单一样品或多种样品的检测。
本发明检测仪器如果通过用实时定量-PCR仪进行扩增产物检测来数据采集和处理，其整个过程都在PCR管内一次性完成，无须将产物转换地方，进行提纯、检测等步骤，并且PCR产物可在PCR管封闭销毁，避免逸出产物造成环境污染。
本发明检测仪器如果通过用寡核苷酸芯片检测来数据采集和处理，其过程是将PCR产物通过移液机转入寡核苷酸芯片检测体系内全自动化完成，其过程是全封闭的，无须进行人工提纯、分离、检测等步骤。
本发明检测仪器可机械化完成全部检测过程，包括加样、孵育、洗管、实时定量-PCR仪(或微阵芯片)的数据检测和数据处理、发报告等。
一种PCR管式检测仪器的检测过程，包括下述步骤1、PCR管的处理(1)用3.5％戊二醛处理聚苯乙烯PCR管37℃，2小时；(2)用三蒸水清洗PCR管三次，3分钟/次；(3)包被a、将单克隆抗体用50ul 1.0mol PH9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上；b、将链菌亲和素(streptavidin)包被在PCR管上，加入带有生物素(biotin，B)的捕捉配体的配基；c、将捕捉配体的配基合成在PCR管上；(4)封闭用含5％脱脂奶粉(或甘氨酸、牛血清白蛋白和poly(dI.dC)等)的碳酸氢钠缓冲液封闭。
(5)干燥，提供制备相应的试剂盒2、检测试剂的制备(1)试剂成分试剂一、a、PH7.4 1×PBS(138mM NaCI，2.7mM KCI，8.1mMNa2HPO4，1.1mM KH2PO4，1mM MgCI2)含人为序列修饰的抗体或配基的2nMol溶解；试剂二、b、引物2×25pmol/ul， 2×1ulc、4×dNTP(每种2.5mM) 8uld、MgCI2(25mM) 6ul
e、10×buffer 10ulf、Taq酶(2-3u) 0.5ulg、分子信标h、加水至 100ul3、检测过程a、将检测样品加入PCR管中，37℃，45分钟孵育；b、洗管机洗PCR管2次，3分钟/次洗液是含0.05％Tween-20，PBS，PH7.4，含1mmol的MgCl2；c、洗管机洗PCR管1次，3分钟/次洗液是PBS，PH7.4含1mmol的MgCI2；d、在PCR管中加入试剂一，37℃，45分钟孵育；e、洗管机洗PCR管3次，3分钟/次洗液是含0.05％Tween-20，PBS，PH7.4，含1mmol的MgCI2；f、洗管机洗PCR管2次，3分钟/次洗液是PBS，PH7.4含1mmol的MgCI2；g、在PCR管中加入试剂二，PCR扩增；h、扩增条件95℃ 5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，72℃5分钟，4℃保存。
4、数据采集和处理本发明仪器具有如下优点1、机械化成度高。利用本发明仪器可使加样、洗管、加试剂、PCR、检测及数据处理等，可全机械化完成。
2、人为修饰序列储存信息量大。本发明的修饰核酸序列为特异寡核苷酸配基末端人为加上的一些不影响其结合活性的核酸序列(可以是ssDNA、dsDNA和RNA)，修饰序列的长短，碱基序列可根据检测目的设计，不同的修饰序列可通过寡核苷酸配基与配体的特异结合反映配体的性质和数量。
3、灵敏度高、特异性强。本发明仪器的检测方法是采用新型免疫-PCR和修饰配基(核酸(类)抗体)的检测方法，是利用抗原抗体的特异结合和配体配基的特异结合，使检测的特异性增强；在配基和配体直接结合形成稳定的复合物时，由于在配体特异结合的寡核苷酸配基上有人为修饰序列，可直接通过PCR指数级富集，对配体信息进行传递和放大，因此其灵敏度有明显的提高。
4、检测样品灵活。可用实时荧光定量PCR检测单一或少量样品，也可以用微阵芯片检测多种样品。
5、准确的信息采集和处理系统。由于本发明仪器的信息采集和处理系统是通过实时定量-PCR检测和微阵芯片检测，故有校准的数据报告。
6、使用器皿单一，操作过程简单、安全。检测时使用器皿单一，即一次性PCR管，操作过程简单，数据采集及处理可在全封闭的情况下完成，扩增产物可封闭销毁，有效保证环境的洁净。
7、本发明的操作简单，易于普及应用。由于在反应时只需将配体和配基室温孵育45分钟就能完成配体和配基的结合反应，因此操作简便，便于一般实验室或临床检验科室的普及应用。
8、利用本发明组装的检测试剂盒或构建的生物芯片可以广泛应用于基础研究与临床检测，可带来一定的经济效益与社会效益。
图1是某一类配体(如Fc片段的配基)特异寡核苷酸配基序列。
图2为新型免疫-PCR检测流程。
图2a抗体IgG的Fc片段特异寡核苷酸修饰配基。
图2b抗体IgG的Fc片段特异寡核苷酸修饰配基PCR扩增产物，荧光信号分子5’荧光分子-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3’序列。
图3是配基检测流程。
图3a是5’生物素化的捕捉配基序列。
图3b是修饰的检测配基序列。
图3c是PCR扩增产物，荧光信号分子5’荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm)-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3’序列。
图4、实时定量-PCR原理图，是在图2新型免疫-PCR检测和图3配基检测的PCR过程中加入核酸分子信标，随着PCR的扩增将产生逐渐强的荧光信号，通过荧光信号的检测、分析进行抗原或配体定量。
图5、四种配基实时定量-PCR检测图。是在配基检测的原理图3上，将PCR管处理后，包被识别四种配体的配基，和检测样品共同孵育，形成四种配体-配基复合物；经清洗后，加入混合的四种经修饰序列标记的识别检测配体的不同配基(四种检测配基的修饰序列标记是和被检测配体、检测配基一一对应)，共同孵育后，洗去未结合的检测配基，针对配基修饰序列PCR扩增，在修饰序列PCR过程中加入了四种不同激发波长和检测波长的核酸分子信标，四种核酸分子信标分别和四种检测配基的修饰序列互补对应，随着PCR的扩增将产生逐渐强的四种荧光信号，通过荧光信号的检测、分析进行四种配体定量。
图5a实时定量-PCR四色荧光检测原理6a芯片检测流程图；芯片检测是在图5四种配基实时定量-PCR检测原理的基础上，扩大捕捉配基和相应检测配基的种类，在配基修饰序列PCR扩增中，通过在引物5’端带有单一的荧光信号(或化学发光信号等)来传递信息，利用寡核苷酸芯片对配基修饰序列PCR扩增产物进行信息识别、定量，从而实现多样微量检测。
图6b是芯片检测原理图具体实施方式
图1是某一类配体(如Fc片段的配基)特异寡核苷酸配基序列，该序列是通过SELEX技术针对配体筛选出的一段20-40个碱基的寡核苷酸片段，再经人为增加修饰序列后，使其变成可携带大量信息的配基序列用于多种配体同时检测示意图。人为序列可以加在5’端、3’端、或5’端和3’端同时加上，长度可以多样，其中PCR所用引物为寡核苷酸配基两端人为添加序列的互补序列。
实施例一新型免疫-PCR检测参照图2，为新型PCR检测流程，将PCR管处理后，包被一抗体，和检测样品共同孵育，形成一抗体-抗原复合物；经清洗后，加入经配基标记的检测抗体，共同孵育后，洗去未结合的检测抗体，针对配基修饰序列PCR扩增，扩增产物的分析、处理。其具体步骤如下1、检测PCR管的制备将PCR管用3.5％戊二醛在37℃处理2小时，三蒸水洗三次，包被捕捉乙肝核心抗原的单克隆抗体(或捕捉配基，包被方法参看实施例二，1)，用含5％脱脂奶粉(或牛血清白蛋白等)，50ul 1.0molPH9.6的碳酸氢钠缓冲液封闭，干燥待用。
2、检测抗体试剂的制备将检测乙肝病毒的小鼠IgG抗体和经序列修饰的小鼠IgG抗体Fc特异寡核苷酸配基(参照见图2a检测配基由两部分组成，第一部分5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCAAGCTAACCCTCATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’为小鼠IgG抗体Fc特异寡核苷酸配基；第二部分双链5’-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’为标志序列)，在PH7.4 1×PBS(138mM NaCI，2.7mM KCI，8.1mM Na2HPO4，1.1mM KH2PO4，1mMMgCI2)共同孵育45分钟，或通过308纳米波长，12焦耳，1分钟紫外交联，使抗体和配基复合物更稳定，(或经过纯化后)分装成检测抗体试剂待用。
3、PCR检测试剂的制备配置含修饰序列的引物15’-TCTAACGTGAATGATAG-3’和引物25’-TATGGTCGAATAAGTTAA-3’，各(25Pmol/ul)1ul；4×dNTP(每种2.5mM)8ul；10×buffer 10ul(含Mg2+)；Taq酶(2-3u)0.5ul(临用前加入)；分子信标(原理见图4)(5’荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm)-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3’)；加水至100ul(可根据检测仪器调整体系量)。
以下操作可由仪器完成1、从试剂盒中取出检测PCR管放入检测架上，将待测样品加入检测PCR管中，同时设阴性和和阳性标准曲线，37℃孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次。洗液是10mmol/L Tris，150mmol/L NaCI，PH7.2，5mmol/L EDTA，0.05％Teen-202、加入检测抗体试剂(实施例一，2)，37℃孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次，洗液同上。
3、加入PCR检测试剂(实施例一，3)预变性95℃5分钟；变性94℃30秒、复性55℃30秒、延伸72℃30秒；终延伸72℃5分钟；共35个循环。
4、实时定量-PCR进行数据采集和处理。
5、打印检测报告。
实施例二参照见图3，配基检测；将PCR管处理后，包被识别配体的配基，和检测样品共同孵育，形成配体-配基复合物；经清洗后，加入经修饰序列标记的识别检测配体的不同配基，共同孵育后，洗去未结合的检测配基，针对配基修饰序列PCR扩增，扩增产物的分析、处理。其具体步骤如下1、PCR管的制备将PCR管用3.5％戊二醛在37℃处理2小时，三蒸水洗三次，包被链菌亲和素；用含5％脱脂奶粉(或牛血清白蛋白和poly(dI.dC)等)，PH9.6的碳酸氢钠缓冲液在37℃处理2小时封闭，用1ml 1.0mol PH9.6的碳酸氢钠缓冲液漂洗三次，每次三分钟；将捕捉小鼠IgG配体的配基25pmol(见图3a)，即生物素-5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTTAGTTGTTCTCCTAGGCATGTTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’，37℃孵育1小时，同上漂洗三次，每次三分钟，干燥待用。(或将捕捉配体的配基合成到PCR管上)2、检测配基试剂的制备用PH7.4 1×PBS(138mM NaCI，2.7mM KCI，8.1mM Na2HPO4，1.1mM KH2PO4，1mMMgCI2)配制修饰序列的检测配基，5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCAAGCTAACCCTCATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAATCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’见图3b检测配基由两部分组成，第一部分5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCAAGCTAACCCTCATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’为小鼠IgG抗体Fc特异寡核苷酸配基；第二部分双链5’-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列 ，其中5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’为标志序列，浓度为0.25Pmol/ul，25ul，，分装成检测配基试剂待用。
3、PCR检测试剂的制备配置含修饰序列的引物15’TCTAACGTGAATGATAG3’；引物25’TATGGTCGAATAAGTTAA3’各(25Pmol/ul)1ul；4×dNTP(每种2.5mM)8ul；10×buffer10ul(含Mg2+)；Taq酶(2-3u)0.5ul(临用前加入)；分子信标5’荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm)-TTTTTTTTTT荧光淬灭分子3’(25Pmol/ul)1ul；加水至100ul(可根据检测仪器调整体系量)。
以下操作可由仪器完成1、从试剂盒中取出检测PCR管放入检测架上，将待测样品加入检测PCR管中，同时设阴性和和阳性标准曲线，37℃孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次。洗液是10mmol/L Tris，150mmol/L NaCI，PH7.2，5mmol/L EDTA，0.05％Teen-202、加入检测配体试剂，37℃孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次，洗液同上。
3、加入PCR试剂，预变性95℃5分钟；变性94℃30秒、复性55℃30秒、延伸72℃30秒；终延伸72℃5分钟；共35个循环。
4、实时定量-PCR进行数据采集和处理。
5、打印检测报告。
实施例三参照图5，实时定量-PCR同时检测四种配体1、检测PCR管的制备将PCR管用3.5％戊二醛在37℃处理3小时，三蒸水洗三次，包被链菌亲和素；用含5％脱脂奶粉(或牛血清白蛋白和poly(dI.dC)等)，PH9.6的碳酸氢钠缓冲液在37℃处理2小时封闭，用1ml1.0mol PH9.6的碳酸氢钠缓冲液漂洗三次，每次三分钟；将四种捕捉配体的配基，浓度25pmol，即1)peptide from HIV-1 Rev，生物素-5’-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCCAGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG-3；2)NS3 protease protein，生物素-5’-GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGUACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG-3’；3)TAR RNA element of HIV-1，生物素-5’-
CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAUACUCGUAGAUACUCGCCGGG-3’；4)MS2 coat protein，生物素-5’GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTACGTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3’。
5’或3’生物素化的捕捉配基，四种捕捉配基分别可捕捉四种靶分子，37□孵育1小时，同上漂洗三次，每次三分钟，干燥待用。(或将捕捉配体的配基合成到PCR管上)。
2、检测配基试剂的制备用PH7.4 1×PBS(138mM NaCI，2.7mM KCI，8.1mM Na2HPO4，1.1mM KH2PO4，1mM MgCI2)配制四种修饰序列的检测配基，1)eptide from HIV-1 Rev，5’-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCCAGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUGTCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’，5’-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’为标志序列；2)S3 protease protein，5’-GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUCGGGAUGUACGCAAGUACUUGGUUCCUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACGTCTAACGTGAATGATAGCTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGACTTAACTTATTCGACCATA-3，5’-TCTAACGTGAATGATAGCTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGACTTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-CTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGAC-3’为标志序列；3)TAR RNA element of HIV-1 nucleic，5’-CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAUACUCGUAGAUACUCGCCGGGTCTAACGTGAATGATAGCACGAGTGTTGTAGATACCCGGTGCTACGGTTAACTTATTCGACCATA-3’，5’TCTAACGTGAATGATAGCACGAGTGTTGTAGATACCCGGTG
CTACGGT TAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-CACGAGTGTTGTAGATACCCGGTGCTACGG-3’为标志序列；4)MS2 coat protein，5’-GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCAGGTGCCTGCAGAAGTTATGCAAAGCTTACTTCACTGCAGACTTGACTCTAACGTGAATGATAGCTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCTTTAACTTATTCGACCATA-3’，5′-TCTAACGTGAATGATAGCTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCTTTAACTTATTCGACCATA-3’，为配基修饰序列，其中5’-CTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCT-3’为标志序列。
标志序列是通过配基与检测靶分子的特异结合可形成一一对应关系，将4×1Pmol/ul，20ul，分装成检测配基试剂待用。(各修饰序列的长度和引物可以根据需要定)。
3、PCR试剂的制备配置含修饰序列的引物15’TCTAACGTGAATGATAG3’；引物25’TATGGTCGAATAAGTTAA-3’各(25Pmol/ul)1ul；4×dNTP(每种2.5mM)8ul；10×buffer 10ul(含Mg2+)；Taq酶(2-3u)0.5ul(临用前加入)；四种不同的激发荧光分子信标，1)5’荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm)-TTTTTTTTTT荧光淬灭分子3’2)5’荧光分子(激发光源波长530nm，检测光源波长555nm)-CTCCCTGAAG荧光淬灭分子3’3)5’荧光分子(激发光源波长585nm，检测光源波长615nm)-AACACTCGTG荧光淬灭分子3’4)5’荧光分子(激发光源波长625nm，检测光源波长660nm)-CCATTGCCAG荧光淬灭分子3’等四种不同荧光分子信标；加水至100ul。
以下操作可由仪器完成1、从试剂盒中取出检测PCR管放入检测架上，将待测样品加入检测PCR管中，37□孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次。洗液是10mmol/L Tris，150mmol/L NaCI，PH7.2，5mmol/L EDTA，0.05％Teen-20。
2、加入检测配体试剂，37□孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次，洗液同上。
3、加入PCR试剂预变性95□5分钟；变性94□30秒、复性55□30秒、延伸72□30秒；终延伸72□5分钟；共35个循环。
4、实时定量-PCR进行数据采集和处理。
5、打印检测报告。
实施例四配体芯片检测1、测PCR管的制备将PCR管用3.5％戊二醛在37□处理3小时，三蒸水洗三次，包被链菌亲和素；用含5％脱脂奶粉(或牛血清白蛋白和poly(dI.dC)等)，PH9.6的碳酸氢钠缓冲液在37□处理2小时封闭，用1ml1.0mol PH9.6的碳酸氢钠缓冲液漂洗三次，每次三分钟；将多种捕捉配体的配基(配体的3’或5’端连有生物素)，浓度为2.5pmol，1)eptide from HIV-1 Rev，生物素-5’-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCCAGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG-3；2)NS3protease protein，生物素-5’-GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGUACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG-3’；3)TAR RNA element of HIV-1，生物素-5’-CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAUACUCGUAGAUACUCGCCGGG-3’；4)MS2 coat protein，生物素-5’GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTACGTGGTCAATTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3’；……等。
37□孵育1小时，同上漂洗三次，每次三分钟，干燥待用。(或将捕捉配体的配基合成到PCR管上)。
2、检测配基试剂的制备用PH7.4 1×PBS(138mM NaCI，2.7mM KCI，8.1mM Na2HPO4，1.1mM KH2PO4，1mM MgCI2)配制含不同修饰序列的检测配体的配基为1Pmol(不同修饰序列的长度和引物是相同，特殊情况也可不同)，1)tide from HIV-1 Rev，5’-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCCAGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUGTCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’，5’-TCTAACGTGAATGATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’为标志序列；2)NS3 protease protein，5’-GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUCGGGAUGUACGCAAGUACUUGGUUCCUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACGTCTAACGTGAATGATAGCTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGACTTAACTTATTCGACCATA-3，5’-TCTAACGTGAATGATAGCTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGACTTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-CTTCAGGGAGCGAGGACCAGACGAC-3’为标志序列；3)TAR RNA element of HIV-1 nucleic，5’-CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAUACUCGUAGAUACUCGCCGGGTCTAACGTGAATGATAGCACGAGTGTTGTAGATACCCGGTGCTACGGTTAACTTATTCGACCATA-3’为配基修饰序列，其中5’-CACGAGTGTTGTAGATACCCGGTGCTACGG-3’为标志序列；4)MS2 coat protein，5’-GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCAGGTGCCTGCAGAAGTTATGCAAAGCTTACTTCACTGCAGACTTGACTCTAACGTGAATGATAGCTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCTTTAACTTATTCGACCATA-3’，5′-TCTAACGTGAATGATAGCTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCTTTAACTTATTCGACCATA-3’，为配基修饰序列，其中5’-CTGGCAATGGGTTATCCCAAGTGCTAAGCT-3’为标志序列。
5)……等等分装成检测配基试剂待用。
3、PCR检测试剂的制备配置含修饰序列的引物125Pmol/ul，2.4ul，5’荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm；或激发光源波长530nm，检测光源波长555nm；激发光源波长585nm，检测光源波长615nm；激发光源波长625nm，检测光源波长660nm)-TCTAACGTGAATGATAG-3’；引物225Pmol/ul，0.4ul，5′TTAACTTATTCGACCATA-3’各1ul；4×dNTP(每种2.5mM)8ul；10×buffer 10ul(含Mg2+)；Taq酶(2-3u)0.5ul(临用前加入)；加水至100ul。
4、检测芯片的制备合成芯片检测探针(1)tidefrom HIV-1 Rev，5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；(2)NS3 protease protein，，5’-GTCGTCTGGTCCTCGCTCCCTG-3’；(3)TAR RNA element of HIV-1 nucleic，5’-CCGGGTATCTACAACACTCGTG-3’；(4)MS2 coat protein，5’-GCACTTGGGATAACCCATTGCC-3’；(5)……
将合成的寡核苷酸单链探针制成检测芯片。
此外，寡核苷酸芯片还可以通过原位合成法制备。
以下操作可由仪器完成1、从试剂盒中取出检测PCR管放入检测架上，将待测样品加入检测PCR管中，37□孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次。洗液是10mmol/L Tris，150mmol/L NaCI，PH7.2，5mmol/L EDTA，0.05％Teen-20。
2、加入检测配体试剂，37□孵育45分钟，洗管3次，3分钟/次，洗液同上。
3、加入PCR试剂，预变性95□5分钟；变性94□30秒、复性55□30秒、延伸72□30秒；终延伸72□5分钟；共35个循环。
4、用寡核苷酸芯片检测仪进行数据采集和处理。
5、打印检测报告。
权利要求
1.一种配体/抗原PCR管式检测试剂盒，该试剂盒包括PCR管，设于试剂盒内，所述的PCR管是以经戊二醛处理的聚苯乙烯作为附着材料，在附着材料上包被捕捉靶分子的抗体或配基制成；检测试剂，用于与PCR管配合检测配体/抗原，其设于试剂盒内，由检测试剂A液和B液组成。
2.如权利要求1所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒，其特征在于所述的A液为带有人为序列修饰的检测配基/抗体；所述的B液是由以下成分组成KCI 50mmol；Tris.CI(pH8.3，室温)10mmol；MgCl215mmol；明胶0.1％；4×dNTP混合物，每种150pmol；序列修饰上游引物100pmol；序列修饰下游引物100pmol；Taq DNA聚合酶2-5U。
3.如权利要求2所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒，其特征在于所述的B液还有25pmol的分子信标。
4.如权利要求3所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒，其特征在于所述的分子信标选自茎环分子信标、DNA双链的SYBR Greenl nucleic acidstain和带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标之一。
5.如权利要求2所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒，其特征在于所述的人为序列为单链茎环结构和两条互补双链，可单独在3’和5’端或同时在3’和5’进行序列修饰。
6.一种的配体/抗原PCR管式检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤(1)用0.04-10％戊二醛，在温度为37℃下处理聚苯乙烯PCR管，1-3小时；(2)用三蒸水清洗PCR管三次，2-5分钟/次；(3)将捕捉靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；(4)将包被有捕捉靶分子的抗体/配基的PCR管用含5％脱脂奶粉或甘氨酸、牛血清白蛋白、poly(dI.dC)或龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液封闭；(5)干燥，将封闭的PCR管装入试剂盒即可制成PCR管；(6)然后将PCR管与检测试剂A液和B液组装成试剂盒。
7.如权利要求6所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的配基包被在PCR管上的步骤是将链酶亲和素包被在PCR管上，并加入带有生物素的配体的捕捉配基，通过链酶亲和素和生物素的特异结合实现将配基包被在PCR管上。
8.如权利要求6所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的配基包被在PCR管上的步骤是以PCR管为载体按照配基碱基顺序合成在PCR管上。
9.如权利要求6所述的配体/抗原PCR管式检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的抗体包被在PCR管上的步骤是将单克隆抗体用PH9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上。
10.一种利用配体/抗原PCR管式检测试剂盒的检测方法，该方法包括下述步骤(1)在包被有捕捉靶分子的配基/抗体的PCR管中，加入待测样品；在37℃，45分钟孵育，使PCR管上的捕捉靶分子的配基或抗体与待测样品中的靶分子的配体或抗原结合，形成复合物；(2)再在上述步骤(1)中形成的复合物中加入检测试剂A液即带有人为序列修饰的检测配基/抗体；使检测配基或抗体与PCR管上包被的捕捉靶分子的抗体或配基和结合的靶分子的抗原或配体形成“三明治”式结构；所述的人为修饰序列具有一对引物和中间的人为标记序列；(3)然后加入检测试剂B液，B液是含有修饰序列一对引物的PCR体系；(4)PCR扩增人为修饰序列，完成修饰序列信号的放大；(5)用实时定量-PCR进行检测，或将修饰序列的互补序列制成微阵列，通过寡核苷酸信片检测扩增后的修饰核酸序列。
11.如权利要求10所述的利用抗原及配体PCR管式检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述的步骤(5)中的实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。
12.如权利要求10所述的带有人为序列修饰的检测抗体或配基，其特征在于所述的配体是指核酸、蛋白质、多肽、有机染料、ATP、金属离子类的任何分子。
13.如权利要求10所述的带有人为序列修饰的检测抗体或配基，其特征在于所述的配基是指能与配体直接结合的特异寡核苷酸配基。
全文摘要
本发明涉及一种以PCR管为附着材料的抗原和配体检测仪器及相应的试剂盒，该方法利用PCR管(聚苯乙烯等材料)经戊二醛等(双功能分子)方法处理，可附着核酸配体(或抗原、抗体及配基等)，通过特异寡核苷酸配基(或携带信号分子的特异寡核苷酸配基)与配体直接结合，将配体信号转换成核酸配基信号，然后经PCR(或滚环复制)扩增放大、检测，来测定配体；该方法检测配体具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体微阵检测和可机械化完成等特点。
文档编号G01N33/533GK1721852SQ20041002634
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者廖世奇 申请人:甘肃省医学科学研究院