专利名称：一种稳定标记肝癌细胞的方法
技术领域：
本发明属量子点免疫荧光细胞化学技术领域，具体涉及一种稳定标记肝癌细胞的方法。
背景技术：
免疫荧光细胞化学技术是采用荧光物质标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物上带有荧光物质，在荧光显微镜下，由于受到激发光源照射，荧光物质发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质。这类技术在现代生物学和医学中被广泛应用，早在60多年前，由Coons等创建的免疫荧光技术，发展至今已有很大的进展。随着高灵敏度和高特异性探针技术的不断发展，以FITC、罗丹明为代表的传统有机荧光染料应用存在的局限性越来越明显激发光谱狭窄而发射谱宽，在成像中不易分辨，对于生物化学反应和代谢的抵抗力弱，抗光漂白能力低，成像发光时间短等。自1997年以来，随着量子点(quantum dots，QDs)制备技术的不断提高，QDs在生物医学方面的应用也逐渐引起了广泛的关注。QDs是一类半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒，作为一种新型荧光材料，QDs能克服传统有机荧光染料的不足，具有激发光谱宽且连续，检测灵敏度高，抗光漂白能力强，荧光强度高而稳定，生物相容性好等特点。目前国外所采取的QDs标记细胞的方法主要是通过链(霉)亲和素—生物素系统结合，这种方法操作较为复杂且成本较高，实用性不强。在癌症研究领域，国内外尚无将QDs应用于肝癌细胞的免疫荧光标记研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种稳定标记肝癌细胞的方法，采用QDs-IgG复合物作为荧光探针，通过特异性AFP抗体间接标记肝癌细胞。方法易行，操作方便，可高效稳定地对肝癌细胞进行荧光标记，对肝癌细胞的长时间观察研究提供了适宜的实验方法。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施，具体步骤如下1.细胞培养人肝癌细胞株HCCLM6(Li Y，Tian B，Yang J，Zhao L，Wu X，Ye SL，Liu YK，Tang ZY.Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cellmodel system with multiple metastatic potentials established through consecutivein vivo selection and studies on metastatic characteristics.J Cancer Res ClinOncol.2004；130(8)460-468)，培养液为含10％胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的RPMI-1640培养基(Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)。培养条件37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度。隔天更换培养液，每4～6天传代一次。
2.细胞培养玻片和培养皿的处理，将20mm×20mm盖玻片和直径9cm的玻璃培养皿用清水洗净，2％(vol/vol)盐酸溶液浸泡过夜，清水浸泡，用软毛刷轻轻刷洗，烘箱烘干，温度控制在50～70℃，放酸缸内经硫酸-重铬酸钾清洁液(浓硫酸100ml，重铬酸钾100g，蒸馏水1000ml)浸泡1～3天，自来水冲洗20次，蒸馏水洗涤10次，浸泡过夜，烘干后，干烤灭菌，温度控制在150～170℃，2h，备用。
3.细胞爬片，将盖玻片平铺于培养皿上，每个培养皿铺4张盖玻片。用0.125％胰蛋白酶(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)消化细胞，按2×106个/每个培养皿接种，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养3d，细胞长满盖玻片。
4.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8g，Na2HPO4·7H2O 2.16g，蒸馏水1000ml)，洗涤2次，每次3min；5.固定，固定液为-20℃甲醇，每张玻片3～5ml，去除多余PBS后，固定15min。
6.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(上述步骤4)，洗涤3次，每次3min。
7.封闭，封闭液为含有1％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)和0.1％(vol/vol)曲拉通X-100(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)。封闭条件为去除多余PBS后，湿盒孵育，37℃，20～30min。
8.加一抗，去除多余封闭液后，滴加鼠抗人AFP单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，湿盒孵育，37℃，1～2h(或4℃冰箱过夜)。
9.洗涤玻片，清洗液为含0.5％(vol/vol)吐温#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，洗涤3次，每次3min。
10.加二抗，去除步骤4中剩余的PBS后，滴加QDs-IgG复合物探针(由武汉大学化学与分子科学学院合成。谢海燕，庞代文.II-VI型量子点制备及其在生物检测中应用研究进展.分析化学研究报告，2004，8(32)1099～1103)，稀释液为含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，稀释后IgG浓度为10μg/ml。湿盒，室温20-25℃避光孵育1h。
11.洗涤玻片，清洗液为含0.5％(vol/vol)吐温#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，避光洗涤3次，每次3min。
12.细胞核复染，去除步骤4中的PBS后，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)，稀释液为含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，稀释后浓度为2μg/ml。湿盒，室温20-25℃避光染色15～20min。
13.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.4，PBS(上述步骤4)，避光洗涤3次，每次3min，缓冲甘油封片，4℃避光保存。
14.荧光显微镜或共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。
本发明与现有传统有机荧光标记技术相比具有以下优点和效果1、成像稳定，在相同的连续激发条件下，本发明荧光标记的细胞的荧光半衰期是以异硫氰酸荧光素(FITC)为代表的传统有机荧光标记的180倍。
2、荧光亮度高，本发明标记的荧光强度可以达到传统有机荧光标记(FITC)的5～20倍。
3、保存时间长，本发明荧光标记的细胞在4℃避光条件下被保存超过一周后，荧光仍然存在，而目前传统有机荧光标记的标本过夜后荧光基本猝灭。
4、标记特异性强，可以克服标本自发荧光的影响。
本发明与目前国外量子点荧光标记方法相比，不必采用链(霉)亲和素—生物素系统来进行结合，省略了相关的亲和素共价修饰量子点、抗体的生物素化等步骤，整个过程3～4小时即可完成，既简化了步骤，操作方便，又节省了相关费用，实用性强。
图1为本发明对人肝癌细胞HCCLM6的免疫荧光标记成像图，其中图A 400×，图B 1000×。按照上述本发明和条件，通过共聚焦激光扫描荧光显微镜，便得到了清晰的肝癌细胞株HCCLM6 AFP抗原的体外标记成像。明亮的橘红色荧光部分为被QDs标记的细胞浆中表达AFP抗原的区域，蓝色部分为DAPI染料标记的细胞核区域。
图2为本发明对人肝癌细胞HCCLM6荧光标记的特异性试验图，1000×。为了进一步证明本技术荧光标记的高特异性，采用特异性鼠抗人AFP抗体作为一抗，QDs-IgG复合物探针作为二抗，进行单染标记人肝癌细胞HCCLM6的AFP抗原，同时用PBS代替鼠抗人AFP抗体作为一抗，并按照同样的方法和条件标记作为阴性对照，共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。其中图A为用特异性鼠抗人AFP抗体作为一抗，QDs-IgG复合物探针作为二抗的标记结果。图B为用PBS作为一抗，QDs-IgG复合物探针作为二抗的阴性对照标记结果。结果显示阴性对照的视野中没有出现明显的QDs橘红色荧光，这与使用特异性一抗的结果形成鲜明的对比，从而证明该技术的特异性强。
图3为本发明标记人肝癌细胞HCCLM6的荧光稳定性试验图，1000×。将本发明和传统的FITC荧光标记进行了比较试验。将固定并分别用QDs-IgG复合物探针和FITC标记的肝癌细胞置于共聚焦显微镜下连续激发1h，每3min自动获取一张图像，并且比较两者在激光连续激发下荧光强度的衰减情况。
其中图A、B、C、D、E显示的是第0、12、24、36、48分钟时获取的图像，采用本发明标记；图a、b、c、d、e显示的是第0、12、24、36、48分钟时获取的图像，采用传统的FITC荧光标记；
图4为连续激发1h的荧光强度标准化曲线，结果显示在1h内，FITC的荧光强度明显衰减，而本发明标记的QDs荧光强度基本保持稳定不变，充分体现了本发明标记荧光的稳定性。
图5为将完全按照实施例1步骤标记的肝癌细胞爬片置于4℃避光保存，每2d观察一次，图A、B、C、D分别表示第0、2、4、8天获得的图像。结果显示标记细胞核的DAPI染料的蓝色荧光第2天就已经消失，而特异性标记细胞浆AFP抗原的QDs橘红色荧光在第8天仍然清晰可见。这更进一步证明了本发明标记荧光保存时间长的特点。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1本发明对人肝癌细胞HCCLM6的荧光标记，步骤如下A.细胞培养人肝癌细胞株HCCLM6，培养液为含10％胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)的RPMI-1640培养基(Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)。培养条件37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度。隔天更换培养液，每4～6天传代一次。
B.细胞培养玻片和培养皿的处理，将20mm×20mm盖玻片和直径9cm的玻璃培养皿用清水洗净，2％(vol/vol)盐酸溶液浸泡过夜，清水浸泡，用软毛刷轻轻刷洗，烘箱烘干，温度控制在50～70℃，放酸缸内经浓硫酸100ml、重铬酸钾清洁液、蒸馏水1000ml浸泡1～3天，自来水冲洗20次，蒸馏水洗涤10次，浸泡过夜，烘干后，干烤灭菌，温度控制在150～170℃，2h，备用。
C.细胞爬片，将盖玻片平铺于培养皿上，每个培养皿铺4张盖玻片。用0.125％胰蛋白酶(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)消化细胞，按2×106个/每个培养皿接种，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养3d，细胞长满盖玻片。
D.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS(KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8g，Na2HPO4·7H2O 2.16g，蒸馏水1000ml)，洗涤2次，每次3min；E.固定，固定液为-20℃甲醇，每张玻片3～5ml，去除多余PBS后，固定15min。
F.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS(上述步骤4)，洗涤3次，每次3min。
G.封闭，封闭液为含有1％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)和0.1％(vol/vol)曲拉通X-100(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)。封闭条件为去除多余PBS后，湿盒孵育，37℃，20～30min。
H.加一抗，去除多余封闭液后，滴加鼠抗人AFP单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，湿盒孵育，37℃，1～2h(或4℃冰箱过夜)。
I.洗涤玻片，清洗液为含0.5％(vol/vol)吐温#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，洗涤3次，每次3min。
J.加二抗，去除多余PBS后，滴加QDs-IgG复合物探针(由武汉大学化学与分子科学学院合成。谢海燕庞代文.II-VI型量子点制备及其在生物检测中应用研究进展.分析化学研究报告，2004，8(32)1099～1103)，稀释液为含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，稀释后IgG浓度为10μg/ml。湿盒，室温避光孵育1h。
K.洗涤玻片，清洗液为含0.5％(vol/vol)吐温#20(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，避光洗涤3次，每次3min。
L.细胞核复染，去除多余PBS后，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)，稀释液为含5％(wt/vol)牛血清白蛋白(AMRESCO，Solon，Ohio，USA)的PBS(上述步骤4)，稀释后浓度为2μg/ml。湿盒，室温避光染色15～20min。
M.洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.4，PBS(上述步骤4)，避光洗涤3次，每次3min，缓冲甘油封片。
N.共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。结果见图1。
实施例2本发明标记肝癌细胞的特异性试验，步骤如下
A.～G.同实施例1，将封闭好的肝癌细胞爬片分为两组，一组以特异性鼠抗人AFP抗体作为一抗，一组以PBS(同实施例1步骤D)作为一抗，按照实施例1步骤H.操作。
I.～K.同实施例1L.缓冲甘油封片，共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。结果见图2。
实施例3本发明标记肝癌细胞荧光稳定性试验，步骤如下A.～I.同实施例1，将洗涤好的肝癌细胞爬片分为两组，一组以QDs-IgG复合物探针作为二抗，一组以FITC-IgG作为二抗，按照实施例1步骤J.操作。
K.同实施例1L.缓冲甘油封片，共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。结果见图3、图4和图5。
权利要求
1.一种稳定标记肝癌细胞的方法，它包括下列步骤为A、细胞培养人肝癌细胞株HCCLM6，培养液为含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养条件37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4～6天传代一次；B、细胞培养玻片和培养皿的处理，将20mm×20mm盖玻片和直径9cm的玻璃培养皿用清水洗净，2％/vol/vol盐酸溶液浸泡过夜，清水浸泡，用软毛刷刷洗，烘箱烘干，温度控制在50～70℃，放酸缸内经硫酸100ml、重铬酸钾100g、清洁液蒸馏水1000ml浸泡1～3天，自来水冲洗20次，蒸馏水洗涤10次，浸泡过夜，烘干后，干烤灭菌，温度控制在150～170℃，2h，备用；C、细胞爬片，将盖玻片平铺于培养皿上，每个培养皿铺4张盖玻片，用0.125％胰蛋白酶消化细胞，按2×106个/每个培养皿接种，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养3d，细胞长满盖玻片；D、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l、pH 7.2～7.4、PBS(KCl 0.2g、KH2PO40.2g、NaCl 8g、Na2HPO4·7H2O 2.16g、蒸馏水1000ml)，洗涤2次，每次3min；E、固定，固定液为-20℃甲醇，每张玻片3～5ml，去除上述的剩余PBS后固定15min；F、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS为上述步骤D，洗涤3次，每次3min；G、封闭，封闭液为含有1％/wt/vol牛血清白蛋白和0.1％/vol/vol曲拉通X-100的PBS，PBS为上述步骤D，封闭条件为湿盒孵育，37℃，20～30min；H、加一抗，去除上述的剩余封闭液后，滴加鼠抗人AFP单克隆抗体，湿盒孵育，37℃，1～2h或4℃冰箱过夜；I、洗涤玻片，清洗液为含0.5％/vol/vol吐温#20的PBS，PBS为上述步骤D，洗涤3次，每次3min；J、加二抗，去除步骤D的剩余PBS后，滴加QDs-IgG复合物探针，稀释液为含5％/wt/vol牛血清白蛋白的PBS，稀释后IgG浓度为10μg/ml，湿盒，20～25℃避光孵育1h；K、洗涤玻片，清洗液为上述步骤I，PBS为上述步骤D，避光洗涤3次，每次3min；L、细胞核复染，去除步骤D的剩余PBS后，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，稀释液为含5％/wt/vol牛血清白蛋白的PBS，PBS为上述步骤D，稀释后浓度为2μg/ml，湿盒，20～25℃避光染色15～20min；M、洗涤玻片，清洗液为0.01mol/l，pH 7.2～7.4，PBS为上述步骤D，避光洗涤3次，每次3min，缓冲甘油封片，4℃避光保存。
全文摘要
本发明公开了一种稳定荧光标记肝癌细胞的方法，其步骤是肝癌细胞培养、爬片及固定；固定的肝癌细胞爬片的洗涤与封闭；肝癌细胞与作为一抗的特异性AFP单克隆抗体的结合；PBS洗涤爬片；用QDs－IgG复合物探针作为二抗进行荧光标记；PBS洗涤爬片；4’，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)复染细胞核；PBS洗涤爬片和标本的避光保存。本发明方法易行，操作方便，可高效稳定地对肝癌细胞进行荧光标记，对肝癌细胞的长时间观察研究提供了适宜的实验方法。
文档编号G01N33/577GK1793925SQ200510020089
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年12月20日
发明者陈良冬, 李雁, 刘佳, 庞代文 申请人:武汉大学