专利名称：Dna结合蛋白磁性纳米粒子分离系统及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，特别是涉及利用纳米粒子分离DNA结合蛋白的系统。
背景技术：
DNA与蛋白质的相互作用包含了大量的生命活动信息，是后基因组时代研究的一个重要内容。特别是，DNA与蛋白质的识别的研究关系到生物大分子的构象特异性识别以及基因转录调节过程中蛋白因子的作用机制等方面问题的解决。传统的研究DNA与蛋白质相互作用的方法存在一些困难凝胶滞后实验(EMSA)只能验证已知蛋白与DNA的相互作用，并且实验中要用到同位素标记，对实验者健康有影响；染色质免疫共沉淀法(CHIP)要预先猜测与DNA作用的蛋白因子，并且要用到该蛋白因子的单抗，成本高，此外，抗体的加入又有可能影响DNA与蛋白的结合。
目前，纳米科学正在突飞猛进地发展，将纳米科学与生物学结合，用于解决生命研究中的重大问题，这是一个纳米科学发展的必然趋势。为了更方便直接地研究蛋白质与DNA的相互作用，建立一种基于磁性纳米粒子(MNP)的微量蛋白因子的分离系统，以筛选与某一特定DNA序列识别的蛋白质正在成为可能。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，以克服现有的凝胶滞后实验只能验证已知蛋白与DNA的相互作用，并且实验中要用到同位素标记，对实验者健康有影响；染色质免疫共沉淀法需要预先猜测与DNA作用的蛋白因子，并且要用到该蛋白因子的单抗，成本高，此外，抗体的加入又有可能影响DNA与蛋白的结合的缺陷。
技术方案本发明的技术方案之一是提供一种DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，由如下组分构成(1)表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子；(2)标记有生物素的双链DNA；(3)与双链DNA结合的核蛋白；(4)外加磁场。
上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统的优选方案之一为，所说的磁性纳米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3纳米粒子，且表面通过氨基或羧基与链霉亲和素共价连接。
上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统的优选方案之二为，所说的磁性纳米粒子平均粒径为50～100nm。
上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统的优选方案之三为，所说的DNA结合蛋白的分子量范围为6.2kD至4.1kD。
上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统的优选方案之四为，所说的生物素标记的双链DNA的片段长度范围为100bp～800bp。
本发明的技术方案之二是提供一种利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法，包括如下步骤a)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3纳米粒子表面进行氨基或羧基修饰；b)在经过修饰的磁性纳米粒子表面共价连接链霉亲和素；c)利用表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子结合生物素修饰的双链DNA；d)利用磁性纳米粒子的超顺磁性分离并洗脱DNA结合蛋白。
上述的利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法的优选方案之一为，所说的磁性纳米粒子平均粒径范围为50～100nm50～100nm。
上述的利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法的优选方案之二为，所说的DNA结合蛋白的分子量范围为6.2kD至4.1kD。
本发明的技术方案之三是提供上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统在研究蛋白质分离及DNA与蛋白质相互作用中的应用。
上述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用的优选方案为，所说的蛋白质为DNA转录因子。
有益效果(1)磁性纳米粒子与长链dsDNA的键合系高效专一，分离过程中蛋白与DNA在最适的结合体系中保持相互特异结合；
(2)采用磁性分离手段，分离的条件温和，对生物样品不产生损伤，并且操作简单、迅速；(3)利用此纳米分离系统可以分离得到DNA结合蛋白，弥补目前DNA结合蛋白质分离方法中的不足，提供了安全、可靠、低成本的技术平台；(4)值得关注的是，本发明方法可以用于寻找未知的DNA结合蛋白，而不是仅限于验证某一蛋白与DNA的识别，这为分离与DNA结合的蛋白质提供了良好的分离平台，并为研究DNA与蛋白质相互作用开辟了新的思路；(5)本发明的方法可以用于筛选并获得转录因子，能够为研究基因调节机制提供更直接的分子水平的证据。
图1磁性纳米粒子捕捉hCMV MIEP结合的蛋白因子。Lane 1Hela核抽提物；Lane MTakara低分子量蛋白Marker；Lane 2标记有hCMVMIEP的MNP由50mM NaCl洗脱液；Lane 3标记有Biotin-primer的MNP由50mM NaCl洗脱液；Lane4标记有hCMV MIEP的MNP由200mM NaCl洗脱液；Lane 5标记有Biotin-primer的MNP由200mMNaCl洗脱液。该图说明hCMV MIEP片段至少可以结合分子量为6.2kD、5.4kD、3.8kD和4.1kD的蛋白。
图2茚三酮显色产物可见光吸收谱.a.MNP-NH2；b.无水乙醇洗涤MNP-NH2的上清液；c.MNP；d.CH3CH2OH。本图说明AEAPS能够通过化学键有效地连接在磁性纳米粒子的二氧化硅表面。
图3MNP-NH2-Strepavidin与OB-hCMV MIEP的特异性结合效率。Lane 10.12mg MNP-NH2-Strepavidin与10pmol OB-hCMV MIEP混合后游离的DNA；Lane2～70.12mg MNP-NH2-Strepavidin与20pmol、18pmol、16pmol、14pmol、12pmol、10pmol OB-hCMV MIEP混合后游离的DNA；Lane MDL2000 Marker。该图说明修饰有Biotin的dsDNA能够有效地与磁性纳米粒子键合，键合效率为12ng磁性纳米粒子结合1pmol DNA。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，引物和探针均由上海生工公司合成。表面包覆有SiO2的磁性纳米粒子由上海师范大学纳米生物技术实验室制备。
具体实施过程中，如下步骤是一种可行和优选的方法(1)用N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)修饰二氧化硅包裹的γ-Fe2O3纳米粒子表面将甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，将表面包覆有SiO2的磁性纳米粒子10～30mg加入上述溶液中，超声25min以上分散均匀，向混合液中滴加1～2mL AEAPS，超声5～20min混匀，50～80℃水浴搅拌反应10～20hr。加外磁场利用顺磁性分离出磁性纳米粒子，甲醇清洗，真空干燥过夜，收集磁性纳米粒子。
(2)磁性纳米粒子表面修饰链霉亲和素取3～5mg修饰过氨基的磁性纳米粒子加入到500μL pH7.0左右的缓冲液(如磷酸盐缓冲液)中，超声分散均匀，加入50～100ug的Strepavidin，溶液室温振荡24hr以上。加入戊二醛(25％水溶液)室温反应2～4hr。用pH5～8左右的缓冲液清洗，将粒子重分散于pH5～8左右的缓冲液中，4℃保存备用。
(3)表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子对生物素修饰的双链DNA的捕捉将20μL上述经过链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子(约含0.05～0.4mg粒子)用10倍体积的缓冲液平衡，与10pmol～20pmol 5’-biotin标记的双链DNA片段(100bp～800bp)混合，室温振荡30min以上。
实施例1表面修饰氨基的磁性纳米粒子的制备将甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，将表面包覆有SiO2的磁性纳米粒子20mg加入上述溶液中，超声20～50min分散均匀，向混合液中滴加1～5mL AEAPS，超声5～10min混匀，50～80℃水浴搅拌反应5hr以上。加外磁场利用顺磁性分离出磁性纳米粒子，甲醇清洗，40～90℃真空干燥过夜，收集磁性纳米粒子。
实施例2磁性纳米粒子表面修饰Strepavidin取3mg修饰过氨基的MNP加入到500μL pH7.0左右的磷酸盐缓冲液(如0.1mol/L，pH7.0)中，超声分散均匀，加入75ug的Strepavidin，溶液室温振荡24hr。加入0.5mL戊二醛(25％水溶液)室温反应2～4hr。用磷酸盐缓冲液清洗，将粒子重分散于磷酸盐缓冲液中，4℃保存备用。
实施例3表面修饰有Strepavidin的磁性纳米粒子对Biotin修饰的双链DNA的捕捉将20μL上述经过Strepavidin修饰的磁性纳米粒子(约含0.15mg粒子)用10倍体积的缓冲液平衡，与10pmol 5’-biotin标记的hCMV MIEP片段(588bp)混合，室温振荡30min。用10倍体积的缓冲液清洗粒子。
实施例4分离与双链DNA结合的蛋白质Hela细胞核抽提物与25pmol hCMV MIEP片段在缓冲液B(8mMHEPES(pH 7.9)，100mM KCl，6mM MgCl2，0.08mM EDTA，0.2mM DTT，8％甘油，0.04mg/mL鲑鱼精DNA)中30℃水浴反应1hr。加入用缓冲液B平衡好的磁性纳米粒子约0.3mg捕捉hCMV MIEP片段与其结合蛋白的复合物，室温振荡反应30min。磁性分离纳米粒子，用5倍体积的缓冲液B清洗粒子，而后依次加入含50～200mM NaCl的洗脱液，室温洗脱5min，收集洗脱液。即得到与hCMV MIEP片段结合的蛋白。
实施例5分离系统在研究DNA与蛋白质相互作用中的应用在获得与hCMV MIEP片段结合的蛋白后，选择可与NFκB、AP-1等转录因子特异性结合的单克隆抗体与聚丙稀酰胺凝胶中的蛋白转渍条带进行免疫印迹分析，获得特异性阳性结果，表明hCMV MIEP片段结合的蛋白中含有特异性转录因子，并进行进一步的分离、测序、同源性比较等。
权利要求
1.一种DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，由如下组分构成(1)表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子；(2)标记有生物素的双链DNA；(3)与双链DNA结合的核蛋白；(4)外加磁场。
2.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，其特征在于，所说的磁性纳米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3纳米粒子，且表面通过氨基或羧基与链亲和素共价连接。
3.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，其特征在于，所说的磁性纳米粒子平均粒径为50～100nm。
4.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，其特征在于，所说的DNA结合蛋白的分子量范围为6.2kD至4.1kD。
5.根据权利要求1所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，其特征在于，所说的生物素标记的双链DNA的片段长度范围为100bp～800bp。
6.一种利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法，包括如下步骤(1)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3纳米粒子表面进行氨基或羧基修饰；(2)在经过修饰的磁性纳米粒子表面共价连接链霉亲和素；(3)利用表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子结合生物素修饰的双链DNA；(4)利用磁性纳米粒子的超顺磁性分离并洗脱DNA结合蛋白。
7.根据权利要求6所述的利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法，其特征在于，所说的磁性纳米粒子粒径范围为50～100nm。
8.根据权利要求6所述的利用磁性纳米粒子分离DNA结合蛋白的方法，其特征在于，所说的DNA结合蛋白的分子量范围为6.2kD至4.1kD。
9.权利要求1所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统在研究蛋白质分离及DNA与蛋白质相互作用中的应用。
10.根据权利要求9所述的DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统的应用，其特征在于，所说的蛋白质为转录因子。
全文摘要
本发明提供一种DNA结合蛋白磁性纳米粒子分离系统，由如下组分构成表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米粒子；标记有生物素的双链DNA；与双链DNA结合的核蛋白；和外加磁场。磁性纳米粒子与长链dsDNA的键合系高效专一，分离过程中蛋白与DNA在最适的识别体系中保持相互特异结合。采用磁性分离洗脱手段条件温和，对样品不产生损伤，并且操作简单迅速。利用此纳米分离系统可以分离得到DNA结合蛋白，为研究DNA与蛋白质相互作用提供了可靠的技术平台。
文档编号G01N33/68GK101045743SQ20061014830
公开日2007年10月3日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者沈鹤柏, 王皓月, 周海清, 费俭, 陈伟 申请人:上海师范大学