专利名称：定性检测食品中赭曲霉毒素a含量试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于免疫分析技术领域，尤其是一种定性检测食品中赭曲霉毒素A 含量试剂盒及其检测方法。
技术背景赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及 其他农副产品后所产生的有毒代谢产物。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性 最强、产量最高的一种，对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾 萎縮、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高度的致癌性。OTA在大多数谷物 中存在，主要包括大麦、小麦、燕麦、玉米和咖啡等。同时，以这些谷物词 养的家禽也会受到污染。所以赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界 关注的毒素。1993年，国际癌症研究院(The International Agency for Research on Cancer)将赭曲霉毒素定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)。由于赭 曲霉毒素a对人体的毒副作用，各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素a的限量 标准，第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会会议对OTA进行了危 险性评价并制定了谷物食品中OTA最大残留量标准为5 li g/kg，我国和欧盟 及其成员国也规定在谷物中最大残留量为5y g/kg。目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如薄层层析法(TLC)、高效液 相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC/MS)等方法。其中，国内外研究 与应用较多的是HPLC法，，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，而且 通常需要专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不 适于大量样品的现场快速检测。酶联免疫测定法ELISA由于其特异性强，灵 敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品的检测等优点越来越受到人 们的青睐。虽然很多科研机构和大专院校的科研人员对赭曲霉毒素A酶联免 疫分析检测方法进行了研究，但是检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实 际应用还有一定的距离。固相膜免疫澳!l定(solid phase membrane-based immuoassay)与固相酶免疫 测定(ELISA)相类似，其特点是以微孔膜作为固相载体。标记物可用酶和各 种有色微粒子，如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。 固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体 也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。常用的固相载体膜为硝酸纤维素 (nitrocellulose, NC)膜、尼龙(nylon)膜等。胶体金标记免疫检测技术(immunogold labelling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原 抗体反应的一种新型免疫标记技术。目前国内外已经有约20余种商品化胶体 金试剂盒出售，如最常见的早早孕检测试纸、淋病检测盒等，但除毒品和兴奋 剂以外，其它小分子化合物的残留检测方面的研究和应用却很少见报导，对 于小分子的生物毒素检测几乎空白。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、检测灵敏 度高、特异性强、准确性好、检测成本低、稳定性较好的定性检测食品中赭 曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法。本发明是通过以下技术方案来实现的一种定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，由试纸条和试剂组构成，其特征在于该试纸条是包被有赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物作为该试纸条检测区A和羊抗兔二抗作为该试纸条有效性标准区B的固相载体。而且，所述的固相载体为硝酸纤维素膜。而且，所述的试剂组包括(1) 稀释液为含有甲醇和吐温的pH9.0磷酸盐缓冲液；使用时用二次 水按照l: 5稀释；(2) 胶体金标记抗体0.5mL。而且，所述的赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物的点样量为0.5-2吗，试纸 条规格为1.0-2.2cmx4.5-9.0cm， A、 B两个区域的宽度相等，皆为3-5mm， A、 B两个区域相距10-15cm。一种应用定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法包括以下步骤(1) 样品前处理；(2) 取胶体金标记试纸条，将金标记抗体与样品稀释液按体积比1: 5混合，竞争反应8 — 12分钟后，吸取100y L该反应混合液加入到包被有半抗原的区 域；(3) 在对照试纸条上的检测线区域和有效对照线区域之间的中心部位滴加 lOOixL的空白对照混合液，在检测试纸条和对照试纸条有效性对照区域均出 现红色且检测区域出现红色线条的情况下，如果检测试纸条检测区域颜色比 对照试纸条的浅，说明样品中含有赭曲霉毒素A。而且，所述的样品前处理为将样品粉粹成粉末状，于干燥箱中40 — 60 。C烘干，取样品加入稀释液，超声萃取20min，离心，取上清液。 本发明的有益效果和优点是l.本发明具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低、稳定性较好等特点，而且适用范围较广。主要适用于食品和粮食中的赭曲霉毒素A含量的定性检测。2. 本发明提供的快速检测方法操作简便、快速，完成全部检测操作过程时 间短，而且检测的精确度高，检测灵敏度可以达到pg/kg级非常适合现场检测 的需要。3. 本发明成本低廉、检测效率高、操作简便，既有经济效益又有社会效益， 是一种创新性较高的具有良好的应用前景的定性检测食品中赭曲霉毒素A含 量试剂盒及其检测方法。
图1本发明金标记试纸条对不同浓度OTA的检测结果。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定 性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，由试纸条和试剂组构成， 其中该试纸条是包被有赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物作为该试纸条检测区 A和羊抗兔二抗作为该试纸条有效性标准区B的固相载体，该固相载体为硝 酸纤维素膜，而且赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物的点样量为lpg，试纸条 规格为1.0x4.5cm， A、 B两个区域的宽度相等，皆为5mm， A、 B两个区域 相距10cm。具体操作如下用半自动点样仪将OTA-OVA的连接物点样于硝酸纤维素膜(1.5 cmxlO cm)上，点样量为lpg，每条点样带体积lpL，每条点样带长5mm。质控带 (control line)包被0.5-1 用PBS稀释50倍的羊抗兔二抗。然后将膜用小 刀切割成一定大小(1.5cmxl.0cm)。先在37。C恒温箱中固定15 min，再浸泡 在lXBSA/PBS封闭30min。将封闭后的膜用稀释液冲洗三次，用滤纸吸干 多余的水分，37t:干燥后，4"C下密闭保存。(胶体金标记抗体的制备参见200510013371.4号专利申请)。 稀释液为含有甲醇和吐温的pH 9.0磷酸盐缓冲液；使用时用二次水按 照l: 5稀释；应用定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法包括以下步骤(1) 样品前处理将样品粉粹成粉末状，于干燥箱中50。C烘干，取样品加 入稀释液，超声萃取20min，离心，取上清液备用；(2) 取胶体金标记试纸条，将金标记抗体与样品稀释液按体积比1: 5混合， 竞争反应10分钟后，吸取100 U L该反应混合液加入到包被有半抗原的区域;(3)在对照试纸条上的检测线区域和有效对照线区域之间的中心部位滴加 100HL的空白对照混合液，在检测试纸条和对照试纸条有效性对照区域均出现红色且检测区域出现红色线条的情况下，如果检测试纸条检测区域颜色比 对照试纸条的浅，说明样品中含有赭曲霉毒素A。下面通过一具体实例，对本发明的效果进行叙述大麦中的赭曲霉毒素A含量的定性检测(1) .样品前处理将大麦经粉碎机充分粉粹成粉末状，于干燥箱中50。C烘干，-20°(:储存备用。分别取大麦样品各5g，分别向各种加标样品中加入 lOmL稀释液，超声提取20min，离心，取上清液备用。(2) .取胶体金标记试纸条，将金标记抗体与样品稀释液按体积比1:5混合， 竞争反应IO分钟后，吸取100uL该反应混合液加入到包被有半抗原的区域， 在对照试纸条上的检测线区域和有效对照线区域之间的中心部位滴加100 u L 的空白对照混合液，观察比较检测区域的颜色，在检测试纸条和对照试纸条 有效性对照区域均出现红色，且检测区域出现红色线条的情况下，比较两试 纸条检测区域的颜色，如果检测试纸条检测区域颜色比对照试纸条的浅，说 明大麦样品中含有赭曲霉毒素A。加标试验在加标试验中，分别向样品中添加不同浓度的赭曲霉毒素A，将加标样品充分混匀，室温静置过夜。其余处理过程同上。在对大麦样品的检测中，分别在2.5、 5和10ng水平进行加标回收试验，目测结果均呈阳性， 且梯度明显。本发明的工作原理采用免疫分析检测技术中的胶体金标记快速检测试纸条定性检测赭曲霉 毒素A，用于样品的初筛，在硝酸纤维素膜上包被赭曲霉毒素A—卵清蛋白(OA)和羊抗兔二抗，以赭曲霉毒素A抗体为免疫检测抗体，胶体金作为检 测反应标记物，采用间接竞争免疫检测法，通过反应混合液垂直流过或层析 扩散的方式，在短时间内完成免疫反应，获得可以直接观察的检测结果。而 且本发明主要采用免疫分析检测技术来检测赭曲霉毒素A，以达到对食品和 粮食作物中的赭曲霉毒素A定性检测的目的，并且试剂盒结构简单、使用方 便、价廉、灵敏度高，检测灵敏度可以达到Pg/kg级。
权利要求
1. 一种定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，由试纸条和试剂组构成，其特征在于该试纸条是包被有赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物作为该试纸条检测区A和羊抗兔二抗作为该试纸条有效性标准区B的固相载体。
2. 根据权利要求1所述的定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于所述的固相载体为硝酸纤维素膜。
3. 根据权利要求1所述的定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于所述的试剂组包括(1) 稀释液为含有甲醇和吐温的pH9.0磷酸盐缓冲液；使用时用二次 水按照l: 5稀释；(2) 胶体金标记抗体0.5mL。
4. 根据权利要求1所述的定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其 特征在于所述的赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物的点样量为0.5-2吗，试纸 条规格为1.0-2.2cmx4.5-9.0cm， A、 B两个区域的宽度相等，皆为3-5mm， A、 B两个区域相距10-15cm。
5. —种应用如权利要求1所述的定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂 盒的检测方法包括以下步骤(1) 样品前处理；(2) 取胶体金标记试纸条，将金标记抗体与样品稀释液按体积比1: 5混合， 竞争反应8 — 12分钟后，吸取100uL该反应混合液加入到包被有半抗原的区 域；(3) 在对照试纸条上的检测线区域和有效对照线区域之间的中心部位滴加 100 UL的空白对照混合液，在检测试纸条和对照试纸条有效性对照区域均出 现红色且检测区域出现红色线条的情况下，如果检测试纸条检测区域颜色比 对照试纸条的浅，说明样品中含有赭曲霉毒素A。
6. 根据权利要求5所述的定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检 测方法，其特征在于所述的样品前处理为将样品粉粹成粉末状，于干燥箱 中40—60。C烘干，取样品加入稀释液，超声萃取20min，离心，取上清液。
全文摘要
本发明属于免疫分析技术领域，尤其是一种定性检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法，该试剂盒由试纸条和试剂组构成，其中该试纸条是包被有赭曲霉毒素A与卵清蛋白连接物作为该试纸条检测区A和羊抗兔二抗作为该试纸条有效性标准区B的固相载体。本发明具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低、稳定性较好等特点，而且适用范围较广。主要适用于食品和粮食中的赭曲霉毒素A含量的定性检测。
文档编号G01N21/31GK101231290SQ200710056558
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月25日 优先权日2007年1月25日
发明者燕 张, 硕 王, 王向红, 郑文杰 申请人:天津科技大学