专利名称：一种测定赭曲霉毒素a的适配体传感器的构建方法
技术领域：
一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，属于生物传感器检测技术领域。
背景技术：
赭曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉属和青霉属的几个种产生的一组结构类似的有毒代谢产物，有A、B、C、D四种化合物，包括7种化学结构相似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农作物的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)。主要产生菌是赫曲霉(Asperillus ochraceus)、纯绿霉(Penicillium verrucosum),对食品污染的范围较广,广泛存在于谷物、咖啡豆、豆类、葡萄·干、啤酒、葡萄汁等各类食物和饲料中，谷物及其副产品是OTA的主要来源。赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制，并制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。目前，赭曲霉毒素A的残留分析方法主要有化学分析法和免疫化学分析法。薄层层析法(TLC)的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，重现性不好和无法实现自动化等缺点，已不能满足现代检测的要求。而液相-质谱联用法(LC-MS)具有灵敏度高、检出率高等特点，其设备昂贵，操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查的要求。免疫分析技术具有较高的灵敏度和特异性，但是高质量抗体的制备过程需要较长的周期，交叉反应率的存在会大大影响检测结果的准确度。适配体是一类在体外筛选的能与相应目标物专一并紧密结合的一类单链寡核苷酸序列，具有热稳定性、可重用性和易于化学合成等优点，与抗体相比具有更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗所不能区分的靶标分子单个取代基修饰的极细微差别。以赭曲霉毒素A的适配体代替抗体作为赭曲霉毒素A识别探针，其体外筛选、体外制备的特点能够有效克服抗体制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存的缺点。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是对DNA进行扩增的一种方法，同时可以精确灵敏的定量样品中极微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超强的扩增效应以及定量分析，以DNA作为检测的标记分子，可以带来更多的优势，如检测限低、灵敏度高、特异性好、操作简单以及高通量分析等。适配体高特异性高亲和性结合目标物的特征结合RT-PCR的扩增和定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号，间接测定待检目标物的含量。本方法的最大优点在于可以实现赫曲霉毒素A飞克级的检测水平，是目如实现赫曲霉毒素A检测灵敏度最闻的一种方法
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，该适配体生物传感器，通过适配体的识别作用和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对赭曲霉毒素A进行间接检测。本发明的技术方案一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，包括链霉亲和素包被PCR管，适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面，适配体传感器的构建，具体步骤为
(1)链霉亲和素包被PCR管
首先将PCR管用50 μ L质量浓度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸盐缓冲液稀释的12. 5ng/mL的链霉亲和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育结束后再用上述碳酸盐缓冲液洗涤三次， 每次3min,以去除未结合的链霉亲和素；
(2)适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O杂交缓冲液将适配体和部分互补于适配体的DNA片段分别稀释到50nM和ΙΟΟηΜ，并将两者以I: I的体积比充分混合，将混合液于每个PCR管加入30 μ L，并在37°C条件下孵育40min，以使互补双链充分杂交并结合到PCR管表面；
所述单链DNA适配体片段和部分互补于适配体的DNA片段序列分别为
适配体5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
与适配体部分互补的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)适配体传感器的构建
在步骤(2)包被好的每个PCR管中，分别加入30 μ L 5X l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀释的赭曲霉毒素A标准品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和适配体充分结合,结合缓冲液为含 10 mM Tris, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2, pH 7. O 的缓冲液，反应结束后，再用结合缓冲液洗涤三次，每次3min，最后将PCR管拍打干净，以去除未结合的赭曲霉毒素A和双链变性释放出的部分互补于适配体的DNA片段；
每个PCR管在30 μ L的体系中进行反应，此体系由以下反应物质组成各O. 6 μ L终浓度均为2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(购自上海开放生物科技有限公司，上海市徐汇区田林路192号)，3μ L终浓度为ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR缓冲液，O. 3 μ L浓度为5U的Taq DNA聚合酶和超纯水补足30 μ L ;将反应物充分混匀，最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定，扩增条件为首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s，57°C退火和延伸30s，总共为39个循环，得到互补于适配体的DNA片段的扩增曲线；再从65°C升温至95°C，每O. 5°C读取一次荧光值，使得扩增后的双链DNA变性，得到DNA熔解曲线；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，
下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3 ’。本发明的有益效果本发明提供了一种适配体生物传感器，通过适配体高亲和结合目标物和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对赭曲霉毒素A进行间接检测。
图I赭曲霉毒素A标准曲线；
图2互补于适配体的DNA片段扩增得到的扩增曲线。图3扩增后的双链DNA熔解得到的熔解曲线。
具体实施例方式实施例I
(1)链霉亲和素包被PCR管 首先将PCR管用50 μ L O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸盐缓冲液稀释的12. 5ng/mL的链霉亲和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育结束后再用上述碳酸盐缓冲液洗涤三次，每次3min,以去除未结合的链霉亲和素；
(2)适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面
用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O杂交缓冲液将适配体和部分互补于适配体的DNA片段分别稀释到50nM和ΙΟΟηΜ，并将两者以I: I的体积比充分混合，将混合液于每个PCR管加入30 μ L，并在37°C条件下孵育40min，以使互补双链充分杂交并结合到PCR管表面；
所述单链DNA适配体片段和部分互补于适配体的序列分别为
适配体5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’，
部分互补于适配体的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA
TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ；
(3)适配体传感器的构建
在步骤(2)包被好的每个PCR管中，分别加入30 μ L 5Χ l(T6ng/g 5ng/g的十倍梯度稀释的赭曲霉毒素A标准品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和适配体充分结合,结合缓冲液为含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的缓冲液，反应结束后，再用结合缓冲液洗涤三次，每次3min，最后将PCR管拍打干净，以去除未结合的赭曲霉毒素A和双链变性释放出的部分互补于适配体的DNA片段；
每个PCR管在30 μ L的体系中进行反应，此体系由以下反应物质组成各O. 6 μ L终浓度均为2 μ M的上游引物和下游引物，I. 8 μ L 20 XEvaGreen染料(购自上海开放生物科技有限公司，上海市徐汇区田林路192号)，3μ L终浓度为ImM的dNTP混合液，3 μ L 10XPCR缓冲液，O. 3 μ L浓度为5U的Taq DNA聚合酶和超纯水补足30 μ L ;将反应物充分混匀，最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定，扩增条件为首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s, 57°C退火和延伸30s，总共为39个循环，得到互补于适配体的DNA片段的扩增曲线；再从65°C升温至95°C，每O. 5°C读取一次荧光值，使得扩增后的双链DNA变性，得到DNA熔解曲线；
上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’，下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。(4)检测灵敏度研究
根据RT-qPCR扩增得到的DNA扩增曲线，在扩增曲线的指数期选取合适的阈值，得到每个赭曲霉毒素A浓度下对应的Ct值，以赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，Ct值为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出赭曲霉毒素A的检测限为lfg/g。(5)特异性研究
以玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素BI、伏马菌素代替赭曲霉毒素A作为检测目标物进行特异性研究，加入的四种毒素的浓度和上述赭曲霉毒素A的加入浓度相同，操作方法同赭曲霉毒素A检测的操作方法一致，获得检测四种毒素的DNA扩增曲线；所得每种毒素浓度下的扩增曲线与未加入任何目标物的空白样的扩增曲线位于同一个位置，Ct值没有发生变化，从而得出检测三聚氰胺的DNA-三聚氰胺抗体偶联物没有识别头孢菌素，此方法的 特异性良好。(6)样品添加回收研究
在IOmL阴性红酒样品加入O. I g聚乙烯吡咯烷酮以使红酒样品澄清，通过过滤去除沉淀物，将处理后的样品稀释10倍,分别添加5X 10_6 ng g \ 1X10_4 ng g SO. 001 ngg 1^O. 01 ng g SO. I ng g \ I ng g ng g 1水平的赭曲霉毒素A标准品，用此方法测定标准品的添加回收率，最终得到的回收率范围在99% 112%，可以用于实际样品的测定。
权利要求
1.一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，其特征在于包括链霉亲和素包被PCR管，适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面，适配体传感器的构建；具体步骤为 (1)链霉亲和素包被PCR管 首先将PCR管用50 μ L质量浓度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸盐缓冲液稀释的12. 5ng/mL的链霉亲和素包被PCR管，每管30 μ L在37°C孵育2h，孵育结束后再用上述碳酸盐缓冲液洗涤三次，每次3min,以去除未结合的链霉亲和素； (2)适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面 用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O杂交缓冲液将适配体和部分互补于适配体的DNA片段分别稀释到50nM和ΙΟΟηΜ，并将两者以I: I的体积比充分混合，将混合液于每个PCR管加入30 μ L，并在37°C条件下孵育40min，以使互补双链充分杂交并结合到PCR管表面； 所述单链DNA适配体片段和部分互补于适配体的DNA片段序列分别为 适配体5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’， 与适配体部分互补的DNA片段5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ； (3)适配体传感器的构建 在步骤(2)包被好的每个PCR管中，分别加入30 μ L 5Xl(T6ng/g 5 ng/g的十倍梯度稀释的赭曲霉毒素A标准品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和适配体充分结合,结合缓冲液为含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的缓冲液，反应结束后，再用结合缓冲液洗涤三次，每次3min，最后将PCR管拍打干净，以去除未结合的赭曲霉毒素A和双链变性释放出的部分互补于适配体的DNA片段； 每个PCR管在30 μ L的体系中进行反应，此体系由以下反应物质组成各O. 6 μ L终浓度均为2μ M的上游引物和下游引物，I. 8μ L 20 X EvaGreen染料，3 μ L终浓度为ImM的dNTP混合液，3yL 10XPCR缓冲液，O. 3μ L浓度为5U的Taq DNA聚合酶和超纯水补足30 μ L ;将反应物充分混匀，最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定，扩增条件为首先95°C预变性30s ;然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s，总共为39个循环；得到互补于适配体的DNA片段的扩增曲线；再从65°C升温至95°C，每O. 5°C读取一次荧光值，使得扩增后的双链DNA变性，得到DNA熔解曲线； 上游引物5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’， 下游引物5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。
全文摘要
一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，属于生物传感器检测技术领域。本发明包括链霉亲和素包被PCR管，适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面，适配体传感器的构建。本发明提供了一种与赭曲霉毒素A高特异性高亲和力结合的单链DNA适配体和部分互补于适配体的DNA片段，通过适配体与赭曲霉毒素A的识别结合，诱导适配体构象的改变从而导致互补于适配体的DNA片段释放，以互补于适配体的片段作为PCR扩增模板，通过扩增后的荧光信号对赭曲霉毒素A进行检测。本发明方法能实现对赭曲霉毒素A超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量赭曲霉毒素A以及其他有害物质的检测提供了一种有效的方法。
文档编号C12Q1/68GK102912020SQ20121040003
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月20日 优先权日2012年10月20日
发明者胥传来, 徐丽广, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊 申请人:江南大学