专利名称：与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽及其应用的制作方法
与肿,移细胞特异性结合的多皿其JOT駄领域本发明属于生物工程与生物医药技术领域，涉及禾,噬菌体展示技术筛选能与肿瘤转移细胞 表面抗原特异性结合的多肽，具体地说，^Zffl原创中瘤和肿瘤转移细M^差异鹏随机12肽噬 菌体际文库，得到可以用作肿瘤转移标志物的特异12月游列。 背景駄肿瘤细l^人原有部位侵入淋巴管、血管或体腔，迁徙到它处而继续生长，形成与原发瘤同样 类型的肿瘤，称为转移[杨光华等《病理学》(第適)，人民卫生出版社，2001年，P87)。从肝7jC平发测中瘤细臓面各种肝的非正常駄，对于鉴另鹏瘤的转移和发展有重要意 义，VEGFR (血管内皮生长因子受体)在很多恶性癌细胞，如恶14fF癌细胞和头颈部扁平上皮癌 细胞的表面高表达(邓靖宇，何生，等.VEGF在肝癌中的作用，世界华人消化杂志，2004， 12(2) :454-458);内源血凝集素在对肺部有高转移性的恶性肿瘤细胞表面含量较高[Raz ^ Meromsky L， Lotan R，等.内源;驢素在正常细胞、肿瘤细胞和肿瘤转移细胞表面的差异就， Cancer Researcia986年7月，46 (7) :3667-3672]。,细胞表面W有可能作为肿瘤转移发生的标志物，在肿瘤诊断、判 后、转归和iWr疗效以及高危人群随访观察等方面，具W^的实用价值c现有,体展示技术通常，纯化了的蛋白进filf选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体。
础上我们运用噬菌体展示技术对细胞表面!)!^进行 ， fflil^种方法可以得到对细胞表 面特异结合的寡肽好。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复 杂而战知，细胞筛选糊辨异性默，背景值高，而且转移与一瞎移肿瘤细胞间细胞表面差异 小。发明内容本发明的目的是克服现有技术，的，不足，,一种与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽 及其鹏c因为趨细胞的表面有大量的糖类、蛋白靴原成分与肿瘤转移相关，所以它们是潜在糊中 瘤标志物。本发明应用原创中瘤细胞和肿瘤转移细鹏，鹏菌体文库进行差异離从而获得 能与肿瘤转移细l^系特异性结合的12肽。本发明自SW480 (原创中瘤细皿)和SW620 (肿瘤转移细皿)差异 噬菌体月婢， 获得选择性鹏合肿瘤转移细胞的12肽，其錢,列如下 Leu-PrO"Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-PrO"Pro 。在f機移细鹏MCF7 (ATCC臓号HTB—22)和T47D (ATCC臓号HTB—133)， 以及高转移细M MD—MB—231 (ATCC皿号HTB—26)和MD—MB—435 (ATCC保藏号 HTB—129)等4个细胞系中，证实了上述12肽与肿瘤的转移能力呈正相关。本发明的有 ^是本发明提供的12肽可以用作肿瘤转移诊断的标志物，并可作为开发 抑制肿瘤转移药物的前体。
图1.是噬菌体展示中各轮对SW620细胞牛寺异性结合噬菌体的回收率，图2.體过四轮筛选得至啲,体以及原始库噬菌粘SW620和SW480细胞结合能力的比较，图3.是105个噬菌,克隆均与SW480和SW620细胞以及空白孔作ELISA检测，图4.是测序后得到的表达四种多肽的噬菌体对SW480、 SW620、 MCF7、 T47D、 MD—MB—231和MD一MB—435的结合能力，图5.歡U痕i微检测12 M肿瘤转移细胞SW620运动能力的影响。实施例l: ^1四,选获得能与SW620细胞表面选择性结合的重组HW体 第一轮将RPMI1640培养S^末(Gibico公司)10.4g，碳MiL钠2.0g溶于800ml双蒸水中， 力口入10ml lmol/LHEPES溶液，再用双蒸7jC将总柳定容到1000ml， 0.22(jm滤鹏滤除菌后4°C 保存；^hM培养基中力口入胎牛血清(FBS，购自天津血液病研顿)和青霉素- 素 :，使 其含量分别超U 10°/通1%, 4'C保存;将战@#基2ml加入到6孑L板的每一个孔中，接入SW620细胞(ATCC 号CCL-228),使细胞密度为106个/孔，在化碳细胞培^中培养约48 小时；弃去培养基，细鹏lxPBS洗涤(10xPBS:氯化钠肌0g，氯化钾2,0g，磷體二钠14.4g， 磷酸二氢钠2.48，溶于800ml去离子水中，调pH輕7.4，再用去离子水定容至1升。lxPBS: 将战10xPBS用去离子水糖10倍，{顿 121 。C下高压灭菌20併中)；加5ml封闭液(含 10mg/ml BSA的PBS)室翻睜育1小时；与此同时，将1X1011原始文库噬菌体(随机12肽M13 噬菌体展示文库试剂盒，购自New England Biolabs公司)加入到2ml封闭液中，4'C封闭1小时； 弃去i^lffl胞孔中的封闭液，将封闭好的麟#^液加入到孔中，室翻睜育2小时；弃去孔中噬 菌鹏液，力口入PBST(含0.1% Tween的PBS )洗10次，PBS洗两次，然后加入lml M液(O. 2mol/L Glycine-Cl，pH 2.2)，洗脱10併中；取出上清，立即加入150^1中和液(lmol/LTris-Cl,pH9. 0); 取5(^1 tt噬菌体，用琼脂4M法测定滴度(具#^"法见本实施例的后部)；同时将噬菌体加入 培养到对数中期的规杆菌ER2738中[F， lacf1 A(lacZ)M15 pioA+B+ zzf::Tn10 (Tef)/fhuA2 supE thi A(lac-proAB) A(hsdMS-mcrB)5 (rk"imTMcrBC)菌株保存在含50%甘油的LB培养基中，存于一70 。C]， 250转/射中，37。C培养扩增4. 5小时；扩增产物10000转/射中离心10射中；将80%的上 清吸到新的离心管中，加入1/6上清体积的PEG溶液，4'C沉淀过夜；10000转/射中离心15粥中， 弃上清；用20(^1 PBS重悬沉淀，10000转/辦中离心5胸(除去剩鄉菌沉淀)，上清转移到 新的0，5mL离心管中，这就是扩增了的噬菌体。用琼脂4M法测定噬菌,度。第二轮分别将SW480 (ATCC臓号CCL-228)和SW620细胞以106细^/孑匕铺到6孑L板 中，培养2天；按照第一轮的方法加入第一轮扩增的噬菌体(滴度约为1X1010)，与SW480细胞 结合，室 育1小时；取出孔中噬菌鹏液，加入到另一个SW480孔中，室翻睜育l小时；取 出第二个SW480细胞i歸孔中的,條液，加入到SW620孔中，室翻桴育2小时； ，扩增 等步骤与第一轮完全相同；用同样方法进行第三轮和第四轮筛选，每一轮筛i^f用的噬菌体数量 约为1X1010。琼脂觀法测定滴度的具体織接种 杆菌ER2738单 到5ml含有盐酸四环素的LB培养基中培养，至ODeoo约为0.5; 取一只^W3ml上层固体LB培养基(含有0.7%琼月謝的13培养基)的體，置于沸7K浴中加热至完全融化，再置于45。C水浴中保温；取10^1待测噬菌鹏液，在lxPBS中进行10倍系列稀 释，至大约10^1,鹏液中含有100个,体；取200W^M杆菌ER2738培鎌，在i歸液 中力口入10Ml糖好的噬菌鹏液，轻轻振荡混匀后^^温下静置5辦中；将加有噬菌体的鄉杆 菌培^J口入至'J战45i:保温的3ml固体LB培养基中，混匀后倒在37。C预保温的IPTG/X-gal 平社，待战固体LB培养基完全凝固后，将平板倒置于37'C培鎌中培糊夜。第二天检查平板，对平肚的蓝色噬0^琎^i十数，再相iSZi顿以稀释度，就得到原噬菌体 溶液中每10pl戶膽的噬菌体pfU (噬斑形fiP^位)M。结果进行4轮富集筛选，每轮对从SW620细臓面M^下来的,体量与加入B鶴体的量 的比值逐渐升高，实现了特异性的富集(见表l)。表l中四轮的Mft/加入量用图l表示。 图l中回收率= 的噬菌体*/加入的暧菌体量，Y轴的单位是X10"6。表l fimSW620特异性结合的噬菌体轮数(pfil)加入噬菌体量 (pfii)回收率(X10力第一轮1.1X1051.1X10111第J3.2X1041. 1X10103第三轮6.0X1051. 1X101055第四轮8.9X1051. 1X101080实施例2:噬菌体对SW480和SW620结合能力的测定SW480和SW620分别以106细醇孔铺到6孑L板中，在二氧化碳细胞培鎌中37。C培养约48 小时(培养基用RPMI1640， 10%FBS， 1%青霉素-链霉素舰)，弃去培养基，PBS洗涤，加A^寸 闭液(含10mg/mlBSA的PBS)室翻浮育l小时；同时，将IX 1()UpfU第四轮扩增得到麟体加 入到2ml封闭液中，4'C封闭1小时;，弃去细胞培养 L中封闭液，向SW480和SW620孔中各加 入2ml封闭好的噬菌体(滴度约为1X1011 )，室翻瞎育2小时；弃去,体，PBST (含0.1% Tween 的PBS)洗涤10次，再用PBS洗涤两次，舰，观i淀各自的滴度；原始文库噬菌体作对照，也 同时进行Jd^^。第四轮得到的噬菌体混合库与SW620结合能力较原始Hm体库提高了 IOO倍， 第四轮得到的噬菌体混合库与SW620结合能力是其与SW480结合的100倍，即第四轮得到的噬结合，见图2。图2中。表示从SW480细|&± 下来的噬菌体数； □表示从SW620细Hi:W^下来的噬菌体数； l:^^对照，翻原始文库噬菌体分别加入SW620和SW480中； 2:表示用第四轮扩增的噬菌体分别加入SW620和SW480中。实施例3:单克隆的噬菌体的分离制备随lnj陬105个筛选4轮后的单克隆噬菌体，加AP树数中期的鄉杆菌ER2738中，37°C， 摇床(250转/併中)培养4. 5 5小时；扩增,10000转/溯离心10溯，^Jl清加入1/6 ^!R的PEG/NaCl溶液，4'C沉^3l夜；10000转/倂中离心15倂中，弃上清；用200^1 PBS重悬 沉淀，10000转/併中离心5射中，除去剩余细菌沉淀；用琼脂ftM法测^i:清液中的M,度， 加入等mR甘油，保存于一20°C。用105 ，菌,克隆对，细胞SW480或SW620进行ELISA检测。在96孑L板中分别力口 入105SW480或SW620细lfi/ L，培养两天后每孔中加入200pl封闭液[5X(w/v)BSA溶于PBS]， 封闭l小时；加入单克隆噬菌体1><101()，敏L50pl，孵育2小时；PBST洗涤5次，用HRP-抗 M13抗体(Phannacia Biotech公司)检测结合的噬菌体颗粒，四錢联苯胺(TMB)为底物，显 色约5辦中，力口入100^1 H2S04中止反应。测定450nm的光吸收值。几乎所有噬菌脾克隆均表 现出对SW620细胞的高结合性，同时对SW480细胞的结合性较低，见图3。图3中横坐标标不同的麟脾克隆，m^标表示平均净吸光值；□标SW620孔的平均净吸光值；■ ^SW480孔的平均净吸光值。图3中^h噬菌,克隆均与SW480和SW620细胞以及空白孑L结合。洗涤后，用辣M:氧 化物臓M13抗体及其底物1MB对針孑US行ELISA反应，并检测J OD450。 SW620或SW480 所在孔的OD45o值减去对应的空白孔OD45o值，得到其舰光值。对針克Ha行了两组检测， 图上 为两组检测的平均值。实施例4:噬菌体基因组单链DNA的提取和12月，列的获得PEG沉淀的,^m舒200|il碘化钠缓冲液(10mmol/LTris-HCl， pH8.0， 1 mmol/LEDTA， 4mol/LNal，室温避光jC存)中，力口入500W ^zK乙醇，室翻睜育10辦中，10000转/倂中离心10 射中，弃上清，用70%乙,沉淀，10000转/分钟离心10分钟，弃上清，重悬沉淀于30 l去 离子水中。以_96 gIII引物(5，"CCCTCATAGTrAGCGTAACO"3，， New England Biolabs随机 十二肽,体展示文库产品)观!l序。测序结果用Prime Primier斷特!译，得至哆鹏列。有4 种不同测序结果，所以对应4种不同的12月诉列。它们是-Leu-Pro-Trp"Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro (1)Ser-Pra-Trp"Ser-Glu-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ala-Pro (2 )Val-Pro-Tn>Met-Glu-PrO"Ala-Tyr-Gln-Aig-Phe-Leu(3)Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Aig-Pro (4)实施例5:对12tt34行多重tmiSS^:b ^^aBlalW猴施例4f泰l酌4个12ttmffi,浏，发现12月游列(1) (2) (3) 的相似性很高，它们的高度保守的序列是Pro-TrpOd-Glu-Pro-X2-Tyr,其中&和X2 ^f樣ftf可氨 基酸，该保守序列对维持12肽的结构和功S誕关键作用。实施例6:对^S细lfiiS行ELISA测定在96孑L板中分别加入l()5sW480或SW620细IS/孔，培养两天；5X104MCF7， T47D， MD— MB—231或MD—MB—435细lfi/孔，培f天。每孔中加入200^1封闭液[5% (w/v)BSA溶于PBS], 封闭1小时。加入单个克隆的噬菌体1X1010 50^1/孔，孵育2小时。PBST洗涤5次后用HRP-抗M13抗体(PhamiaciaBiotech公司)检测结合的麟体颗粒，四氨基麟胺(1MB)为底物， 显色约5射中，加入100^1 H2S04中lbS应。领啶450nm的光吸收值。替舰照为对各细胞系均 没有特异性的原始文库Ht0体。测序得到的四种多肽对多种高转移能力的肿瘤细胞有高结合，而对多种i鹏移/不转移的肿瘤细胞结合很弱。进一频实本发明的12月游列对转移肿瘤细胞的特 异结合具有广i皆性，见图4。图4中 迈^^,多肽1噬菌体对各种细胞系的结合□ ^^ii多肽2噬菌体对各种细,的结合■ ^^,多肽3噬菌体对各种细J^的结合H表示,多肽4噬菌体对各种细iam的结合□，原始文库噬菌体对各种细皿的结合 实施例7:划痕^i正明12月i^f肿瘤细皿动能力的影响在24孑版#^孔的底面作标己(如用賴什字， 点和十字可用于后续微中的定位比较， 赫用记号笔作禾斜己定位)。在24孑L板的齡孔中分另咖入3X1()5SW620细胞，培养2—3超 形成的单细鹏驢90—100%針孔的底面积。用黄色吸絲在单层细!Tbl定位点划直线划 痕。用培养難轻洗去划掉的细胞。敏L加入107超多肽1的噬菌体，这种噬菌体就的12肽 序列为Leu-Pro-Trpiys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pra。加107对转移肿瘤细胞没有特异性结合的 原始库,体作为对照。用 清培养基(培养基用RPMI1640， 1%青霉素-链霉素 )培养， 并在O、 5和24小,照(图像放大倍数为40)。以24孑L鹏的fei己将同一个孔不同时间点的图 像錢，观察肿瘤细胞的运动能力，证明这种12肽在体外可以抑制離移月中瘤细胞的运动能力， 见图5。图5中上面一行g向SW620细胞中力口入原始文库噬菌体，TM—行图^^示向SW620中加入了特异结合转移肿瘤细胞的噬菌体，糊n^的时间^^帳后不同的拍照时间。SEQUENCE LISTING<藩南开大学〈120〉与肿瘤转移细胞特异性结合的多船其細<歸4〈210〉 1〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 A!i^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) <223>〈400〉 1Leu Pro Tip Lys Glu Pro Tyr Tyr Leu Met Pro Pro1 5 10〈210〉 2〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX序列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 2Ser Pro Tip Ser Glu Pro Ala Tyr Tyr Leu Ala Pro1 5 10<210〉 3〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AI)^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 3Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Trp Gin Aig Phe Leu1 5 10〈210〉 4<211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX/^列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE 〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 4Ser Val Ser Val Gly Nfct Lys Pro Ser Pro Aig Pro1 5 10
权利要求
1.与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列如下Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。
2. 权利要求l戶舰的多肽在制备检测肿瘤转移试剂中的鹏。
3. 权利要求l戶做的多肽在开发抑制肿瘤转移药物中的細。
全文摘要
本发明涉及与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽及其应用。本发明所述与肿瘤转移细胞表面抗原特异性结合的多肽的氨基酸序列为Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。该多肽具有与肿瘤转移细胞特异性结合和抑制肿瘤转移细胞运动的特性。因此，该多肽可以用作肿瘤转移诊断的标志物，并可应用于开发抑制肿瘤转移药物的前体。
文档编号G01N33/574GK101319008SQ20081012863
公开日2008年12月10日 申请日期2005年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者张宏恺, 张翠竹, 曹又佳, 鑫 李 申请人:南开大学