专利名称：三聚氰胺快速检测试纸条和试纸卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测三聚氰胺的器具，特别是涉及一 种快速分析三聚氰胺的快速检测试纸条和试纸卡。二、 技术背景2007年，在美国发生了多起狗、猫等宠物因食用含三聚氰胺的食品而发生 中毒死亡的"毒粮"事件，2008年9月份，我国爆发了性质恶劣、危害严重的 因食用含三聚氰胺奶粉导致婴幼儿肾结石甚至肾衰竭的"毒奶粉"事件。三聚 氰胺引发的食品安全问题受到了国内外的极大关注。三聚氰胺(Melamine， MEL)又名蜜胺，氰尿三酰胺，是一种重要的氮杂 环有机化工原料，主要用来与甲醛縮合聚合制备三聚氰胺树脂，可用于塑料及 涂料工业，也可作纺织物防褶、防縮处理剂。MEL因其分子中含有大量氮元素， 以常用的凯氏定氮法测定产品中的蛋白质含量时，不能区分这种伪蛋白，因而 一些不良厂家将MEL添加到饲料和食品中，以提高产品中蛋白质的检测数值， 降低产品成本，牟取暴利。目前，国内外测定词料和食品中MEL的方法，主要是采用理化分析方法， 包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)、液相色 谱/质谱联用分析法(Liquid chromatography/PBSs spectrometry, LC/MS)、气相 色谱/质谱联用分析法(Gas chromatograph/PBSs spectrometry, GC/MS)、电位滴 定法、浊度法、重量法、苦味酸法和升华法等。这些检测方法，待检样品需经 一系列复杂的处理净化，从样品处理到得出检测结果需要2天以上时间，繁琐 费时；同时这些检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法进 行现场检测，难以推广。由于这些方法的局限性和严重的滞后性，使监控三聚 氰胺的非法使用变得异常困难，无法保证食品安全监控的有效性。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种特异强、灵敏度高，能快速、简便地 检测三聚氰胺试纸条和试纸卡。 本发明的技术方案是一种三聚氰胺快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、 金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，所述金标结合垫为吸 附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋 白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或 羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼 龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被 膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗 体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋 白。所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上， 保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为"I I "，或者为"+ "，或 者为" "。一种三聚氰胺快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯 包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫， 其特征是所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗 体，三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼 龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被 膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有 放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相 对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为"I I "，或者为"+ "，或 者为" "。本发明的检测试纸条和试纸卡具有下列优点① 特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记 高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无 共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗 体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡 具有较强的特异性和较高的敏感性，检出MEL最低限量可达到10ppb。② 简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任 何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条(卡)加入被检样品液后，在10分钟 内即可判定检测结果。③ 结果显示形象、直观、准确。检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线"I " 和"I I "作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线"I " 时，表示在被检样品中含有三聚氰胺，显示两条棕红色线"| I"时，表示在 被检样品中不含三聚氰胺。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现 假阳性和假阴性等人为误判。④ 节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范 围广，可满足不同层次人员需要，包括实验室检验、口岸检验、集贸市场卫生 监督、加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。四
图l、三聚氰胺快速检测试纸条俯视结构示意图。 图2、三聚氰胺快速检测试纸条剖面结构示意图。 图3、三聚氰胺快速检测试纸卡俯视结构示意图。 图4、三聚氰胺快速检测试纸卡剖面结构示意图。图中，1:衬板，2:样品垫，3:金标结合垫，4:包被膜，5:检测线，6: 对照线，7:吸水垫，8-1:样品浸入端保护膜，8-2:手柄端保护膜，9:标识线， 10:力口銜L 11:观察窗，12:面板，13:鄉芯固定槽，14:鹏，15:面板凹槽。五具体实施例方式要制成快速检测三聚氰胺试纸条(卡)，首先要制备偶联三聚氰胺载体蛋白 和三聚氰胺金标抗体，从而制备检测线和金标抗体纤维。其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体，用于制备对照线。(1) 三聚氰胺与载体蛋白偶联采用戊二醛法，将三聚氰胺与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。 戊二醛法反应偶联，取2mgMEL溶于lmLlmol/LPBS溶液中，加入30pL 戊二醛，常温下搅拌反应lh。然后加入含10mg BSA或OVA或KLH的PBS 溶液，RT搅拌反应过夜。反应液用葡聚糖凝胶Sephadex G-25过柱纯化，制得 人工结合抗原BSA-MEL或OVA-MEL或HSA-MEL，冻干，一20。C保存备用。(2) 抗三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体的制备单抗制备以50pg 100pg/只的三聚氰胺载体蛋白偶联物免疫6 8周龄 Balb/C小鼠3 4次，每次免疫间隔时间3 5周，确定抗体效价符合要求后超 强免疫，之后3 4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用 75M酒精浸泡小鼠5 10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经 120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将1乂108的脾细胞与 NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min弃上清，细胞沉淀物于37'C水浴中缓缓加入0.7 1.0mL的50°/。PEG4000作用lmin,然后缓缓加入 无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37。C水浴5 10 min， 1000rpm 离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细 胞培养板孔(100pL 200nL/孔)，置于37。C、 5%(:02培养箱中培养。培养10 14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺 盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备 的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与三聚氰胺反应，亲和力常数达到 109 101G,轻链亚型为K或入，重链亚型为IgG,、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3 ，针对 三聚氰胺特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。多抗制备用三聚氰胺载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为 200吗 50(^g/次，背部皮下分4 6点注射。首免，用无菌PBS溶解三聚氰胺 载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解三 聚氰胺载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化，首免后2 3周进行，连 续免疫4 5次，每次间隔2 3周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测 定其效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取 IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS (pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵 溶液混匀，置4。C冰箱12h， 4°C、 2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4i:冰箱2h， 4°C、 2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4"C冰箱内 用PBS (pH7.2)透析48 72h，中间换液数次，4°C、 12000rpm离心15min， 收集上清，得纯化的抗三聚氰胺多克隆抗体，一2(TC冻存，用于制备金标抗体 玻璃纤维棉。(3)三聚氰胺金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的200ML 0.01 0.02%氯 金酸溶液中加入新鲜配制的1 %柠檬酸钠8mL，获得直径约15nm的胶体金溶液， 用0.1mol/LK2C03调pH值至8.5 9.5，置2 8"C保存备用。以1: 2000的标记比将待标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5 9.5的金溶胶中， 标记10min后，加入20%的PEG10000至终浓度为0.05%， 4'C、 1500 3000rpm 离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C、 15000rpm离心lh，弃上清，获初 步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S—400柱层析进行分离纯化， 获得三聚氰胺胶体金标记抗体。将l: 100 1: 500稀释的胶体金标记抗体吸附 于精制玻璃纤维棉中，4'C低温真空干燥，制备三聚氰胺金标抗体玻璃纤维棉。(4) 羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备 羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体的制备以饱和硫酸铵提取三聚氰胺阴性小鼠血清IgG (或阴性兔血清IgG)，即取1 份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS (pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液 混匀，置4。C冰箱12h， 4°C、 2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS(pH7.2) 溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4'C冰箱2h， 4°C、 2500rpm离 心15min，弃上清，以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4'C冰箱内用PBS (pH7.2) 透析48h，中间换液3次，4°C、 12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光 光度计测定其蛋白浓度，以5(^g 100pg/kg体重的小鼠血清(或兔血清)IgG 经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次，末次注射10天后，以ELISA测定 其血清效价达到1: 2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱 和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清 IgG相同，不再重述)，用于三聚氰胺快速检测试纸条对照线的制备。(5) 三聚氰胺快速检测试纸反应原理当三聚氰胺快速检测试纸测试端加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸 作用带动待测三聚氰胺及金标抗体玻璃纤维棉中的金标抗体一起向包被膜扩 散，并最终渗入手柄端吸水垫。在扩散过程中，待测三聚氰胺可与金标抗体相 结合，进而封闭金标抗体上三聚氰胺的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜 上偶联三聚氰胺载体蛋白的检测线结合，不显示检测线，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照线"I "，即显示一条棕红色线"I "为阳性表示。反之样品溶液中无三聚氰胺则不能阻止金标 抗体与纤维素膜上偶联三聚氰胺载体蛋白的检测线结合，显示棕红色检测线"I "，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显 示棕红色对照线"I ",形成两条棕红色线"II "为阴性表示。如果纤维素膜上 没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。实施例一MEL快速检测试纸条，参见图1和图2。图中衬板1用硬质塑 胶条制成；样品垫2用玻璃纤维棉制成；金标结合垫3采用具体实施方式
"5" 中所述的方法制备，采用有胶体金标记的抗MEL单克隆抗体玻璃纤维棉；包被 膜4采用硝酸纤维素膜；隐形检测线5用MEL-载体蛋白偶联物在包被膜4上印 制，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA;隐形对照线6用兔抗小鼠IgG抗体溶液在 包被膜4上印制，两条线平行排列组合为"I I ";手柄端的吸水垫7用吸水滤 纸制成。将样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、手柄端的吸水垫7从右至左依 次粘贴固定在塑胶条1上，彼此之间交界处纤维互相搭接。样品端白色保护膜8 一l覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，黄色保护膜8—2覆盖在手柄端吸水垫 7上，测试样品标示线9位于样品垫2与金标结合垫3交界处，即位于对应的白 色保护膜8—1上且偏向样品垫2 —侧约0.5cm处，在标示线9右侧保护膜上印 有箭头及MAX字样，以方便使用。 检测样品制备① 饲料样将样品磨细，以生理盐水进行1: 2 1: 5稀释，静置沉淀后 取上清液，用于检测分析。② 奶样取奶样2ml在15X:条件下3000r/min离心5min，除去上层脂肪， 取下层液用生理盐水作l: 2 1: 5稀释，静置沉淀或5000r/min离心5min，取 上清液，用于检测分析。检测方法将MEL检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过 标记线，约10 20秒钟取出检测试纸条，水平放置，IO分钟内观察检测结果。 结果判定①阳性如果在包被膜上显示有一条棕红色线"I "，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有MEL;②阴性如果在包被膜上显示有两 条棕红色线"I I "，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含MEL;③失效如果在包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。实施例二检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于以抗MEL多克隆抗体替代抗MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；偶联MEL的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照印迹。隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为"+ "，或者隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为" "。其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。 实施例三检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于 图中衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用尼龙膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MEL载体蛋白为鸡卵清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。 实施例四检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于-图中衬板1用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚偏二氟乙烯膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MEL载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。实施例五检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于 图中衬板l用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚酯膜制成；以抗MEL多 克隆抗体替代抗MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；包被膜 4采用羧化纤维素膜；MEL载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6甩羊抗兔 IgG抗体溶液在包被膜上印制。其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。 实施例六MEL快速检测试纸卡，参见图3、图4。图中衬板l、样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、隐形检测线5、隐形对照线6和吸水垫7，其制备方 法与实施例一相同，共同组成试纸芯；试纸卡壳体材料为塑料，壳体底座14上 设有固定试纸芯的固定槽13;面板12上的加样孔10与试纸芯的样品垫2相对 应，加样孔10是滴加待检样品的位置；面板12上设有和底座相结合的凹槽15， 在面板12上的观察窗11与试纸芯的包被膜4相对应，是观察判定结果的窗口， 其旁边印有T和C，分别与包被膜4上的隐形检测线5和隐形对照线6相对应。 检测样品及检测样品制备和实施例一相同。检测时，将试纸卡平放，从加样孔滴加待测样品液，10分钟内从观察窗判 定检测结果。结果判定如在包被膜4上对应T的位置显示有一条棕红色线"I "时， 表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有MEL;如在包被膜4上对应T、 C 的位置显示有两条棕红色线"I I "时，表示检测结果为阴性，说明待测样品 不含MEL;如在包被膜4上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。实施例七检测试纸卡结构和实施例六基本相同，不同之处在于以抗MEL 多克隆抗体替代MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；偶联MEL 的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在 包被膜上制备对照线"I "。另外，本发明试纸卡的试纸芯中衬板l、样品垫2、金标结合垫3、包被膜 4、隐形检测线5、隐形对照线6和吸水垫7，可为实施例一 五的任意一种，试 纸卡壳体除塑料外，还可用不吸水的木质或金属等材料制作，以及与本发明构 思相同的其他类似变换均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种三聚氰胺快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，其特征是所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。
2. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是所述衬板为硬质塑胶条或不吸 水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜； 所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或 羧化纤维素膜。
3. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是所述三聚氰胺金标抗体为胶体 金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛 血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。
4. 根据权利要求1所述的试纸条，其特征是所述保护层为保护膜，该保护 膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标 记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。
5. 根据权利要求l-4任一项所述的试纸条，其特征是所述隐形检测印迹和 隐形对照印迹排列方式为"I I "，或者为"+ "，或者为" "。
6. —种三聚氰胺快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯 包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。
7. 根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。
8. 根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是所述衬板为硬质塑胶条或不吸 水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜； 所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或 羧化纤维素膜。
9. 根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是所述壳体由底座和面盖构成， 底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观 察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相 对应。
10. 根据权利要求6-9任一项所述的试纸卡，其特征是所述隐形检测印迹 和隐形对照印迹排列方式为"I I "，或者为"+ "，或者为" "。
全文摘要
本发明公开了一种三聚氰胺快速检测试纸条和试纸卡。试纸条含有衬板、样品垫、金标结合垫、纤维素膜、吸水垫，试纸条两端粘贴有保护膜，金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用三聚氰胺-载体蛋白偶联物印制的隐形检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印制的隐形对照印迹。将不带保护膜的试纸芯放在特制的壳体中即得到试纸卡，壳体面板上设有加样孔和观察窗。本发明试纸条和试纸卡可现场操作，无需任何其它试剂和仪器，试纸条上加入被检样品液后，在10分钟内即可判定检测结果，并且特异性强、灵敏度高，使用简便、快速、直观、准确，适用范围广、成本较低，易推广应用。
文档编号G01N33/543GK101408545SQ200810230848
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者刘庆堂, 张改平, 杨继飞, 杨艳艳, 柴书军, 王自良, 职爱民, 东 赵, 邓瑞广 申请人:河南省农业科学院