专利名称：4种不同基因亚型猪圆环病毒2型分子克隆毒株的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组毒株，尤其涉及猪圆环病毒2型标记毒株及其构建方法，本发明 还涉及上述毒株的应用，属于重组猪圆环病毒2型毒株领域。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)主要引起断奶仔猪多 系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS),该病于 1997 年在加拿大首次被证实，美国、法国、日本、韩国等相继发现猪群中存在PMWS (Mankertz A, DomingoM, Folch J M, et al. Characterization of PCV2 isolates from Spain, Germany and France[J]. Virus Research,2000,66(1) :65-77 ；Ellis J, Clark E, Haines D, et al. Porcine circovirus-2 and concurrent infections inthe field[J]. Veterinary Microbiology,2004,98 :159-163 ；Wellenberg GJ, Stockhofe Z N, Boersma W J, et al. The presence of co-infections inpigs with clinical signs of PMWS in the Netherlands :case_control study[J]. Research Veterinary Science,2004, 77⑵177-184.)。除PMWS夕卜，猪皮炎与肾病综合征，猪呼吸道综合征，繁殖障碍，肉 芽肿性肠炎，坏死性淋巴腺炎，渗出性皮炎，先天性震颤等也与PCV2感染有关。病毒 感染的致病性主要与机体免疫系统相互作用有关，PCV2感染对猪免疫功能的影响以及 由此引起的免疫抑制等问题备受国内外学者关注，已成为近年来的研究热点(Cheung A K.Transcriptionalanalysis of porcine circovirus type 2 [J]. Virology, 2003,305 168-180 ； Cheung A K.Comparative analysis of the transcriptional patterns ofpathogenic and nonpathogenic porcine circoviruses[J]. Virology, 2003,310 :41-49 ；Nawagitgul P，Morozov I，Bolin S R，et al. Open readingframe 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J]. Journal of General Virology，2000，81 :2281-2287 ；Liu J，Chen I，Kwang J.Characterization of a previously unidentified viral protein inporcine circovirus type 2一infected cells and its role in virus-inducedapoptosis[J]. Journal of Virology,2005， 79 :8262-8274 ；Liu J，Chen I，Du Q，et al. The 0RF3 protein of porcine circovirus type 2 is involved inviral pathogenesis in vivo[J]. Journal of Virology,2006, 80:5065-5073.)。有关PCV2变异的研究不断增多，世界范围内PCV2不断变异(Wen L B，Guo X，Yang H C. Genotyping of porcine circovirus type 2from a variety of clinical conditions in china[J]. Veterinary Microbiology, 2005,110 :141-146 ；刘 新文，曹胜波，郭东春，等.猪II型圆环病毒(PCM)Henan株的分离与全基因组序列分 析[J]·中国预防兽医学报，2006, ) :357-359 ；Fenaux M, Halbur P G, Gill M, et al. Genetic characterization of type 2 porcine circovirus(PCV2)from pigswith postweaning multisystemic wasting syndrome in differentgeographic regions ofNorthern America and development of adifferential PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assay todetect and differentiate between infectious with PCV-I and PCV-2[J]. Journal of Clinical Microbiology,2000,38(7) :2494-2503 ；Choi K S, Chae J S. Genetic characterization of porcine circovirus type 2 inRepublic of Korea [J]. Research in Veterinary Science, 2008,84 :497-501. )。Segales 等对不 同PCV2分离株进行标准命名，主要分为PCMa、PCV2b和PCV2c三个基因型，此命名标准 有利于今后对PCV2的研究和命名规范(www.pcvd.net) (Grau R L, Crisci E, Sibila M, etal. A proposal on porcine circovirus type 2 (PCV2)genotype definitionand their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence[J]. Veterinary Microbiology，2008，128 :23-35.)。此外，Yang 等报道中国出现新的 PCV2 变 异毒株，将其命名为PCV2d基因型，显示PCV2流行毒株不断变异且有变异毒株出现(Wang F，Guo X，Ge X N，et al· Genetic variation analysis of Chinese strains ofporcine circovirus type 2 [J]. Virus !Research，2009，145 :151-156.)。Ciacci 等报道临床中 不同基因型PCV2共存，其与地理分布无相关性(Ciacci J R，Simon N L，Pinto L S，et al. Detection of porcineCircovirus type 2 (PCV2)variants PCV2-1 and PCV2-2 in Brazilian pigpopulation[J]. Research in Veterinary Science，2009，87 :157-160.)。 Dupont等证明，PCV2病毒基因序列与其致病性没有直接相关性，并分离到基因组为1766nt 的毒株(Dupont K, Nielsen E 0, Bakbo P, etal. Genetic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a currentPMWS case-control study supports a shift in genotypes with time [J]. Veterinary Microbiology, 2008，128 :56-64.)。自 2003 年以来， 世界范围内PCV2基因型存在转型现象，并预言新型PCV2是更好的适应型毒株，其致病性会 增强。Grau等报道目前世界范围内PCV2流行呈现由散发到广泛流行趋势。目前，PCV2流行 毒株基因型存在PCVh向PCV2b转型现象，但还没有确凿证据证明该两种基因型存在潜在 的毒力差异，并预言将来有可能出现新的变异毒株(Grau RL,Fraile L,Segales J. Recent advances in the epidemiology,diagnosisand control of diseases caused by porcine circovirus type 2 [J]. TheVeterinary Journal, 2010 (in press)·)。世界范围内 PCV2 不 断发生变异，中国存在PCVh、PCV2b和PCV2d三种基因型流行毒株，不同基因型PCV2生物 学特性及致病性差异尚未见报道，有必要对中国目前流行的不同基因型PCV2致病性差异 进行深入研究。 近年来，中国猪群中因PCV2感染引起的相关疾病日益严重，其发病率和死亡 率不断增加，给养猪业带来巨大的经济损失。国外学者对有关PCV2流行毒株变异的报 道较多(Fenaux M，Halbur P G，GillM, et al. Genetic characterization of type 2 porcine circovirus(PCV2)from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in differentgeographic regions of Northern America and development of adifferential PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assay todetect and differentiate between infectious with PCV-I and PCV-2 [J]. Journal of Clinical Microbiology,2000,38 (7) :2494-2503 ；Choi K S, Chae J S.Genetic characterization of porcine circovirus type 2 inRepublic of Korea[J]. Research in Veterinary Science，2008，84 :497-501 ；Grau R L，Crisci E，Sibila M，et al. Aproposal on porcinecircovirus type 2(PCV2)genotype definition and their relation withpostweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence[J]. Veterinary Microbiology, 2008, 128 :23-35 ；Wang F, Guo X, Ge X N, etal. Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type2[J]. Virus Research, 2009,145 :151-156 ；Ciacci J R, Simon N L, PintoL S, et al. Detection of porcine Circovirus type 2(PCV2)variants PCV2-1 and PCV2-2 in Brazilian pig population[J]. Research in VeterinaryScience, 2009,87 :157-160 ；Dupont K, Nielsen E 0, Bakbo P, et al. Genetic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a currentPMWS case-control study supports a shift in genotypes with time[J]. Veterinary Microbiology, 2008,128 :56-64.)，PCV2 基因组由 1767 或 1768nt 组成，最近发 现 1766nt 的新毒株(Wang F, Guo X, Ge X N, etal. Genetic variaion analysis of Chinese strains of porcine circovirus type2 [J]. Virus Research,2009,145 :151-156 ；Dupont K, Nielsen E 0, Bakbo P, et al. Genetic analysis of PCV2 isolates from Danish archivesand a current PMWS case-control study supports a shift in genotypeswith time [J], Veterinary Microbiology, 2008,128 :56-64 ；郭龙军，陆月华，危艳武，等.我国 部分地区猪圆环病毒2型遗传变异分析[J].中国预防兽医学报，2009,31(11) =856-859 ； 黄立平，刘长明，危艳武，等.抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和活性单克隆抗体的制备及鉴 定[J]·中国预防兽医学报，2009,31 ) :132-136.)表明PCV2流行毒株在不断发生遗传变 异。中国猪群中PCV2流行毒株一般认为以PCV2b基因型为主，也可能存在PCVh和PCV2d 基因型，最近还发现有1766nt基因型和Cap蛋白变异株，表明中国PCV2流行毒株存在多样 性特点(郭龙军，陆月华，危艳武，等.我国部分地区猪圆环病毒2型遗传变异分析[J].中 国预防兽医学报，2009，31 (11) :856-859)。猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的相关疾病日 益严重，流行毒株基因不断发生变异，根据病毒基因组差异分为PCVh、PCV2b和PCV2c三个 基因型，还有PCV2d基因型新报道，这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。为 了探讨不同基因型PCV2毒株的致病性差异，需要通过感染性克隆技术拯救具有不同基因 型特点的代表性毒株。
发明内容
本发明目的之一是提供猪圆环病毒2型标记克隆毒株；本发明目的之二是将上述猪圆环病毒2型标记克隆毒株应用于PCV2流行毒株基 因分型的鉴定；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株，对拯救的毒株进行体 外生物学特性试验，本发明所构建的4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆，经转化细胞 后拯救 4 株毒株，分别命名为 PCVh/rCL、PCV2b/rYJ、PCV2b/rJF、PCV2d/rBDH 株。其中，PCVh/rCL的微生物保藏号是CGMCC No. 4306。分类命名是猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2)；保藏时间是2010年11月10日；保藏单位是中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所。
5
PCMb/rYJ的微生物保藏号是CGMCC No. 4308。分类命名是猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2)；保藏时间是2010年11月10日；保藏单位是中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所。PCMb/rJF的微生物保藏号是CGMCC No. 4307。分类命名是猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2)；保藏时间是2010年11月10目；保藏单位是中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所。PCV2d/rBDH株的微生物保藏号是CGMCC No. 4309。分类命名是猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2)；保藏时间是2010年11月10日；保藏单位是中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所。经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实 本发明所拯救的4个克隆毒株属于不同基因型的PCV2毒株；本发明所拯救的毒株均通过细 胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105 (lTCID5(l/ml ；用具有中和病毒活性的 单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测，拯救的PCVh/rCL毒株与该单抗产生特异 性反应，另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应，表明它们属 于不同基因型代表毒株。这表明中国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型，其病毒抗原特 性各异，本发明所构建和拯救的4个代表不同基因型PCV2克隆毒株，为进一步研究其致病 性差异奠定了基础，可作为PCV2流行毒株基因分型的鉴定。为了探讨不同基因型PCV2毒株的致病性差异，通过感染性克隆技术拯救具有不 同基因型特点的代表性毒株，对获得的克隆病毒体外试验结果表明，这些毒株在抗原性、 基因组酶切位点分布、繁殖规律等多项指标存在差异，表明中国猪群中流行PCV2毒株十分 复杂，不同基因型毒株共存。PCV2 0RF2编码Cap蛋白是该病毒的主要结构蛋白，也是病毒的保护性抗原，近年 来，该蛋白也不断发生变异(郭龙军，陆月华，危艳武，等.我国部分地区猪圆环病毒2型遗 传变异分析[J].中国预防兽医学报，2009，31 (11) =856-859 ；Shang S B, Jin Y L，JiangX T, Zhou J Y, Zhang X, Xing G, He J L, Yan Y, Fine mapping ofantigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus and antigenicphenotype of porcine circovirus type 2[J]. Molecular Immunology,2009,46 :327-334 ；Olvera A, Cortey M, Segales J. Molecular evolution ofporcine circovirus type 2 genomes :Phylogeny and clonality [J]. Virology, 2007, 357 :175-185)。对分离毒株 0RF2 推导的氨基酸序列分 析发现，PCV2b基因型YJ毒株和PCV2d毒株(BDH)由于0RF2编码蛋白阅读框架发生改变， 导致Cap蛋白C末端有1 2个氨基酸延伸现象。周继勇等报道的毒株(EU257516)，由于 基因组第1060位有一个碱基缺失，其0RF2基因发生突变，导致了 0RF2编码Cap蛋白C末 端有两个氨基酸(N 和 E)延伸(Shang S B，Jin Y L，Jiang X T，Zhou J Y，Zhang X，Xing G,He J L,Yan Y. Fine mapping of antigenic epitopes on capsidproteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcinecircovirus type 2[J]. Molecular Immunology, 2009,46 :327-334)。本发明通过感染性克隆拯救的rYJ株(1766nt)，在基因组第1039位也发现有一个碱基缺失，导致了其0RF2基因阅读框架发生改变，引起了 0RF2 编码Cap蛋白C末端有两个氨基酸(N和E)延伸。Olvera等Q007)研究也证实，0RF2终 止密码子发生突变，会导致Cap蛋白C末端有一个赖氨酸(K)延伸(Olvera A，Cortey M， Segales J. Molecularevolution of porcine circovirus type 2 genomes :Phylogeny and clonality[J], Virology,2007,357 :175-185)。本发明拯救的 rBDH毒株，由于 0RF2 终 止密码子发生突变，导致了 Cap蛋白C末端分别有一个赖氨酸(K)的延伸，与上述研究报告 基本一致。此外，Knell等已报道基因组1767nt毒株(GenBank序列号AY71!M70)，由于基 因组第1042位有一个碱基T缺失，其0RF2基因发生突变，导致了 0RF2编码Cap蛋白C末 端有一个赖氨基酸(K)延伸(Knell S, Willems H, Hertrampf B, Reiner G. Comparative genetic characterization of porcine circovirus type2 samples from German wild boar populations [J]. VeterinaryMicrobiology, 2005,109 :169-177.)。本发明选择 4 个 不同基因型PCV2流行毒株，以其0RF2阅读框架不同为目标，对碱基缺失或突变可能会引起 该病毒Cap蛋白抗原性、致病性及毒力的改变作为突破口，试图阐明基因遗传变异规律与 致病性改变是否存在相关性。关于PCV2感染性克隆的构建及病毒拯救已有不少报道，不同方式获得的拯救病 毒各有所长(郗鑫，陈焕春，陈华平，曹胜波，琚春梅.猪II型圆环病毒全基因组的克隆及 感染性鉴定[J]·微生物学报，2004，44 O) :172-176.)。本发明采用KOD高保真PCR反应， 使扩增产物保真度较普通Taq酶提高了 70倍，有效地保证了研究结果的可靠性。在PCR 引物设计上引入了 Ml I内切酶位点，可作为遗传标记物，构建的克隆毒株与野生型亲本毒 株相鉴别。本发明构建的感染性克隆及拯救病毒技术，具有显著优势，操作简便，重复性好， 拯救病毒带有分子标记，易于鉴别。由于PCV2感染细胞不产生明显细胞病变，采用常规方 法分离病毒极易污染外源病毒，因此，采用感染性克隆途径获得克隆毒株是解决这一问题 关键，获得的毒株更加纯净。通过对克隆毒株体外细胞培养特性的了解，掌握了病毒繁殖规 律，使克隆毒株体外增殖能力大幅提高。本发明为深入开展猪圆环病毒2型的分子生物学、 致病机制、分子鉴别诊断及免疫学的研究开辟了新途径。
图IIPMA法对不同基因型PCV2拯救的4个克隆毒株的鉴定。图2PCV2拯救的克隆病毒粒子的免疫电镜观察。图3拯救病毒4株PCV2基因组PCR-RFLP鉴定结果。图4克隆的4个PCV2毒株不同代次病毒体外增殖曲线。图5IPMA方法对拯救的PCV2毒株不同时间点增殖规律的鉴定。图6抗原捕获ELISA法检测1D2单抗对4个拯救的PCV2毒株的抗原反应活性。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1材料与方法1. 1细胞毒株质粒抗体按文献方法(刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的 培育和鉴定[J].中国预防兽医学报，2006，沘(3) =248-252.)采用H(15细胞(无PCVl污 染)对临床送检的PCV2阳性病料进行病毒分离培养，获得PCV2/CL、PCV2/YJ、PCV2/JF和 PCV2/BDH四株不同基因型PCV2临床流行毒株，它们具有代表不同基因特性(郭龙军，陆 月华，危艳武，等.我国部分地区猪圆环病毒2型遗传变异分析[J].中国预防兽医学报， 2009,31(11) :856-859.)。重组杆状病毒表达的PCMa/LG株Cap蛋白单克隆抗体(mAb) 1D2 制备参考文献(黄立平，刘长明，危艳武，等.抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和活性单克隆 抗体的制备及鉴定[J]·中国预防兽医学报，2009,31 ) :132-136) 01. 2 试齐[JKOD-Plus-高保真PCR扩增试剂盒为"Toyobo产品；限制性内切酶、pMD18_T载体购 自TaKaRa产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen，T0P10感受态菌购自天根公司，质 粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。1. 3引物设计和PCR扩增参考GenBank AF201311序列设计引物，上游引物为PCV2-F，下游引物为PCV2-R， 由TaKaRa公司合成。序列如下PCV2-F 5' -GTCGACGGAGGAAGGGGGCCAGTT-3‘；PCV2-R 5' -GTCGACTGTTCTGTAGCATTCTTCCA-3‘(下划线处为I 酶切位点)。PCV2全长扩增的PCR反应体系如下PCV2检测用的上下游弓丨物PCV2-F/ PCV2-R(20y M)各 0. 5 μ 1，10XKOD Buffer 2. 5 μ 1,2. 5mM dNTP 2. 5 μ l,25mM MgS04 1 μ 1，K0D高保真DNA聚合酶0. 5U，按传统方法提取的病毒核酸2. 5 μ 1，加入灭菌双蒸水至 25 μ 1。PCR 反应条件为预变性 94°C 5min ；；35 个循环，94°C 20s, 62°C 30s, 68°C 2min，最后 68°C延伸lOmin。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。1. 4病毒基因组克隆及重组质粒鉴定按照DNA胶回收试剂盒的步骤对PCR产物进行回收，取回收产物与pMD18_T载体 连接，连接反应体系为4μ 1回收的PCR产物，5 μ 1 Solution Ι，1μ1 pMD18_T载体，16°C 连接过夜，然后转化T0P10感受态细胞，在IPTG、X-gal诱导下37°C培养1 16h，挑取5 个白斑菌落接种LB液体培养基，培养过夜后按质粒提取试剂盒的步骤提取质粒，质粒用内 切酶Ml I进行阳性重组子的酶切鉴定。同时每个流行毒株选取3个上述经酶切鉴定的 阳性克隆送上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定。1. 5病毒基因组环化及DNA转染细胞经测序印证和酶切鉴定后，将阳性转化菌进行扩大培养并提取质粒，并对提取质 粒进行Ml I酶切。对酶切胶回收产物用T4 DNA聚合酶进行环化，环化体系为20μ1，其中 IOXT4 DNA Iigationbuffer 2μ 1, T4 DNA Iigase 2 μ 1，胶回收产物 16 μ 1，16°C，30min。 将环化的DNA按照转染试剂盒程序进行H(15细胞转染试验。1. 6克隆毒株的拯救及免疫学鉴定
对拯救的感染性克隆毒株，按常规方法进行病毒细胞传代，取第4代病毒液同步 接种H(15细胞于96孔板内，病毒感染细胞72h固定细胞，用PCV2阳性血清进行IPMA法检 测克隆毒株的免疫学反应情况。1. 7克隆毒株电镜形态学观察取克隆毒株第10代细胞培养物，反复冻融3次，取3ml病毒液，12，000r/min离 心30min，小心吸取上清，按1 %体积加入PCV2阳性血清抗体混勻，置4°C过夜，然后进行 12，000r/min离心30min，弃掉上清，用50 μ 1 PBS液(ρΗ7. 4)溶解沉淀，取样进行2%磷钨 酸负染，电镜观察病毒粒子形成的免疫复合物。1. 8克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP分析按1. 3和1. 4项对拯救病毒基因组扩增并进行序列测定，选用!^ba I和Acc I限 制性内切酶分别对拯救的4株毒株基因组PCR扩增产物进行酶切鉴定(PCR-RFLP)。1. 9克隆毒株细胞传代毒价测定采用IPMA法(刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层 细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报，2007，四(8) :621-624.) 对4株克隆病毒株的不同代次进行毒价测定，计算病毒半数细胞感染量(TCID5(l/ml)，测定 不同基因型PCV2毒株体外细胞增殖规律。1. 10克隆毒株感染细胞动力学测定取克隆毒株的第10代细胞培养物，同步接种新消化的HQ5细胞于96孔细胞培养 板，同设PCV2/LG参考株为阳性对照和未接种病毒细胞为阴性对照。病毒接种后12h、Mh、 48h、60h、72h、84h、％h不同时间点固定细胞，采用IPMA法检测病毒感染细胞动力学增殖规律。1. 11克隆毒株抗原性差异鉴定采用重组杆状病毒表达的PCVh/LG株Cap蛋白制备的具有中和抗体活性的单克 隆抗体(1D2株)(黄立平，刘长明，危艳武，等.抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和活性单克 隆抗体的制备及鉴定[J].中国预防兽医学报，2009,31 ) :132-136)建立了一种抗原捕获 ELISA方法用于检测细胞培养物中的病毒抗原。采用该方法分别对克隆毒株第10代细胞培 养物进行了检测，鉴定拯救的不同基因型PCV2毒株抗原性差异。2试验结果2. 1病毒感染性克隆的构建采用高保真DNA聚合酶PCR法对来自临床病料进行PCV2基因组扩增，获得4株病 毒全基因PCR产物，将其分别克隆至pMDIS-T载体上，获得的4株重组病毒全基因组克隆 (PMD18-PCV2-CL、pMD18_PCV2_YJ、pMD18_PCV2_JF 和 pMD18-PCV2_BDH)，经核酸序列分析证 明，代表了不同基因型PCV2毒株(PCMa、PCV2b和PCV2d)，详见表1。表1不同基因型PCV2细胞分离亲本株生物学特性
9亲本毒林名称
项目
PCV2/CLPCV2/YJPCV2/JFPCV2/BDH基因型PCV2aPCV2bPCV2bPCV2d分离时间2008200820082008基因组大小17681766176717670RF2大小702708702705ORFl大小945945945945GenBank登录号HM038033HM038032HM038022HM038017与1D2单抗反应性YesNoNoNo2. 2病毒的拯救及鉴定对4株拯救的病毒进行细胞传代，取各自第4代培养物用猪抗PCV2高免血清进行 IPMA鉴定，结果显示，拯救的4个毒株均呈阳性反应，拯救的4株病毒均获得成功，分别命名 为 PCV2a/rCL, PCV2b/rYJ, PCV2b/rJF, PCV2d/rBDH 株(图 1)。2. 3克隆毒株免疫电镜观察对4株拯救的病毒细胞培养物进行免疫电镜观察，各自样品均有病毒粒子存在， 粒子直径约17nm，与PCV2病毒粒子形态一致，证明拯救的病毒属于PCV2，如图2所示。2. 4克隆毒株基因组测序及PCR-RFLP分析经测序结果表明，获得的4株拯救病毒株基因组序列与亲本毒株序列一致，表明 通过感染性分子克隆拯救的4株不同基因型PCV2获得成功。然后，选用Acc I和!^ba I内 切酶分别对4株PCV2拯救毒株基因组的PCR扩增产物进行了酶切鉴定，结果表明，用Acc I酶切反应可将这4株病毒分为3种基因型，依次为PCVh/rCL、PCV2b/rJF、PCV2b/rYJ和 PCV2d/rBDH(图3A)。用!^ba I酶切鉴定，可将这4株病毒中的PCV2b(rJF、rYJ)基因型中 2个毒株进行区分(图:3B)。基于上述2种限制性内切酶反应建立了 PCR-RFLP方法，可作 为PCV2流行毒株基因分型鉴定。2. 5克隆毒株体外细胞传代毒价测定对拯救的4个病毒株的不同代次细胞培养物进行了毒价测定，结果表明，拯救的 病毒株于1、2代增殖比较缓慢，自第3代起病毒增殖加快，于第8、9代时毒价基本稳定，可 达到105 0TCID50/ml以上，结果见图4。2. 6克隆毒株感染细胞动力学测定对克隆的4个不同基因型PCV2毒株不同时间点繁殖规律的测定，结果表明，24h开 始出现明显的病毒感染阳性细胞，第72h时病毒增殖达高峰，之后由于病毒繁殖量较大，引 起部分细胞裂解，释放的病毒感染周围细胞，病毒感染阳性细胞呈扩散性分布，见图5。
权利要求
1.猪圆环病毒2型标记克隆毒株PCV2a/rCL，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4306。
2.猪圆环病毒2型标记克隆毒株PCV2b/rYJ，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4307。
3.猪圆环病毒2型标记克隆毒株PCV2b/rJF，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4308。
4.猪圆环病毒2型标记克隆毒株PCV2d/rBDH株，其微生物保藏号是CGMCCNo. 4309。
5.权利要求1-4任何一项所述的猪圆环病毒2型标记克隆毒株在制备鉴别猪圆环病毒 2型毒株的试剂中的用途。
6.权利要求1-4任何一项所述的猪圆环病毒2型标记克隆毒株在制备预防或治疗由猪 圆环病毒2型所引起的疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了猪圆环病毒2型标记毒株及其构建及其应用。本发明构建了4个PCV2不同基因亚型的感染性分子克隆，经转化细胞后拯救4株毒株，其微生物保藏号分别是CGMCC No.4306、CGMCCNo.4307、CGMCC No.4308和CGMCC No.4309。本发明所拯救的4个克隆毒株属于不同基因型的PCV2毒株，所拯救的毒株均通过细胞连续传10代，病毒增殖能力稳定，毒价均可达到105.0TCID50/ml；本发明所构建和拯救的4个代表不同基因型PCV2克隆毒株为进一步研究其致病性差异奠定了基础，可作为PCV2流行毒株基因分型的鉴定。
文档编号G01N33/569GK102120987SQ201010591968
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者刘长明, 危艳武, 郭龙军, 陆月华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所