专利名称：分泌抗喹诺酮类药物单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术：
氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones, FQs)是一类人工合成的广谱、高效的抗菌药物。作为兽药和饲料添加剂而大量应用于动物，导致其残留在动物可食性产品中。这类残留物可直接对人体造成危害引起软骨毒性、关节疼痛和肿胀、皮肤过敏反应、白细胞和血小板减少、嗜酸细胞增多、溶血、肝肾损伤等。更严重的是低浓度的残留药物可能会对FQs类药物敏感的致病菌产生耐药性，从而间接威胁人类健康。为此许多国家对喹喏酮类抗生素制定了严格的限量标准，我国该类抗生素的最高残留限量达氟沙星在牛、羊、家禽肌肉中为200ii g/kg、奶中为30ii g/kg，二氟沙星在牛、羊、猪肌肉中为400ii g/kg、家禽中为300 ii g/kg，恩诺沙星在牛、羊、猪、家禽肌肉中均为IOOii g/kg。目前采用的检测手段主要有微生物抑制分析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层色谱和气质联用，液相色谱方法及质谱联用方法等。目前主要用GC或HPLC进行测定。这些方法虽然有较高的灵敏度，但需昂贵的实验仪器，操作复杂、费时费钱、不能高通量检测，故难以在基层普及应用。而用抗体为基础开发的免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条能有效克服这些不足。目前国内外没有检测喹诺酮类药物残留的免疫试剂盒及试纸条，本发明专利应用竞争抑制ELISA原理，以喹诺酮类药物单克隆抗体为核心建立检测喹诺酮类药物残留的竞争ELISA方法，并组装成有自主知识产权、廉价、灵敏的喹诺酮类药物残留检测试剂盒，应用免疫胶体金的原理，以胶体金标记环丙沙星特异性单克隆抗体为核心研制喹诺酮类药物残留快速检测的高灵敏度的免疫试纸条。发明专利的单抗及其免疫学检测试剂盒和试纸条完全满足中国、欧盟、日本等地区对喹诺酮类药物残留的检测要求。喹诺酮残留的免疫学检测方法、免疫学试剂盒及免疫试纸条的国产化对保障我国食品安全及食品的出口创汇具有重要意义，可产生巨大的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No. 5608，它能分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体；
杂交瘤细胞株分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7以上，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星和双氟沙星有特异性免疫反应。抗喹诺酮类药物单克隆抗体在食品中该类抗生素残留检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条。本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的抗喹诺酮类药物单克隆抗体特异性强、灵敏度高，能满足开发免疫学检测方法及试剂盒的要求；以该发明提供的单抗为核心建立的检测食品中喹诺酮类药物残留的竞争ELISA方法及免疫学试剂盒和试纸条能特异、准确、灵敏、简单、快速、高通量地检测食品中喹诺酮类药物的残留。
图I是试纸条的特异性分析，每个样品的含量为IOOppb ；
图2是试纸条的组织样品检测灵敏度分析；
图3是试纸条的蜂蜜样品检测灵敏度分析；
图4是试纸条的原奶样品检测灵敏度分析。
具体实施例方式分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞，于2011年11月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为CGMCC No. 5608，分类命名为分泌抗氟喹诺酮类药物单抗杂交瘤细胞；
杂交瘤细胞株分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7以上，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星和双氟沙星有特异性免疫反应。抗喹诺酮类药物单克隆抗体在食品中该类抗生素残留检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条。本发明提供的杂交瘤细胞株能分泌抗喹诺酮类药物单抗，且其特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测食品中喹诺酮类药物的高通量的免疫学竞争ELISA方法及其免疫学试剂盒和试纸条，从而对保障我国食品安全及食品的出口创汇具有
重要意义。下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。I.环丙沙星半抗原与载体蛋白的交联
I.环丙沙星(CIP)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联产物的制备方
法
a)将60 mg环丙沙星和30 mg EDC溶于2 ml超纯水中。然后立即快速加入30mg/ml的BSA (或者0VA)水溶液1ml，搅拌反应12-18小时，合成CIP-BSA、CIP-OVA偶联产物。b) CIP-BSA、CIP-OVA偶联产物放入透析袋中，用0. OlM pH7. 2的磷酸盐缓冲液在4°C透析2天；
c)透析后的CIP-BSA偶联产物、CIP-OVA偶联产物、CIP、BSA、OVA溶液进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度。结果发现CIP-BSA偶联产物的紫外扫描图形与BSA、环丙沙星的扫描图形明显不同，CIP-OVA偶联产物的紫外扫描图形与0VA、环丙沙星的扫描图形明显不同，说明环丙沙星已与BSA、0VA偶联成功，偶联产物分装后于_20°C冰箱保存，用于抗体制备及检测食品中喹诺酮类药物残留的免疫学方法中的环丙沙星人工抗原。
分泌抗环丙沙 星单抗杂交瘤细胞获得及其单抗制备 I)免疫动物
用CIP-BSA偶联物免疫四周龄体重18-20 g BALB/C雌性小鼠1 mg/ml CIP-BSA偶联物0. 5-0. 7 ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点加腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2-0. 3ml/只，共进行5次加强免疫，末免用不加佐剂的加倍剂量抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。2)骨髓瘤细胞的制备
采用SP2/0为实验的骨髓瘤细胞，直接从细胞培养瓶中吹打悬浮的SP2/0，并计数细胞，活细胞数应高于95%为合格；一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3-6月应用8-氮-鸟嘌呤筛选一次，以防止细胞的突变。3)免疫脾细胞的制备
免疫3天后，小白鼠眼球放血后拉颈处死，收集血清并离心，上清冻存，做阳性对照；将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒5分钟，取出固定于板上，在无菌条件下取脾；把脾放入5mL1640液中，轻轻洗去脾上的红血球；用折弯后的巴氏管轻轻挤压脾，制成脾细胞悬液，用吸管将悬液移入无菌离心管中；并以400g离心3-5 min (与此同时应开始制备骨髓细胞);把沉淀用约10 mL的新鲜培养液再悬浮；计数细胞，活细胞数高于80%为合格。4)细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在无血清的RPMI-1640 (Gibco)培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养基，用50 % PEG (聚乙二醇，分子量为1500，Sigma)作为融合剂，在37°C下水浴下加入0. 5-0. 7ml，使其融合2 min,用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min,沉淀用HAT筛选培养基(Sigma)悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37°C，5 % C02的细胞培养箱中培养。5)杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞在培养箱中培养5天后，用HAT筛选培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-30%时，用环丙沙星偶联卵清蛋白(CIP-OVA)作为包被抗原进行间接ELISA方法筛选阳性孔，共获51多个对环丙沙星有反应的阳性孔，阳性率为5 %。阳性孔进一步用间接竞争ELISA鉴定筛选，选择6个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆3-4次，获得IFl I株能分泌抗环丙沙星的特异性抗体的杂交瘤细胞株。间接竞争ELISA分析发现该单抗的半数抑制率IC50及20%的抑制率IC20分别为3. 65 ng mL'O. 51 ng mL—1。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。6)细胞冻存
细胞冻存液所含血清的量为40%，冻存液中含8-10%的DMSO ;细胞浓度为IO7个/mL ;细胞冻存管放入冻存盒后放入-80 °C，几天后转入液氮中长期保存；含青霉素100 U/mL，环丙沙星 100 Ii g/mL。7)细胞复苏
从液氮罐中取出冻存管，立即放37°C水浴中速溶I min;400g离心3 min，无菌操作打开冻存管，弃上清，细胞用HT培养基重新悬浮，取出细胞悬液，转入细胞培养瓶；培养箱中培养，2小时后吸掉培养上清，加入新的培养基培养。8)单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10X IO5个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000-5000 rpm离心3-5 min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。采用辛酸-硫酸铵法进行单克隆抗体免疫球蛋白的分离沉淀。取I倍体积腹水加2倍体积0. 06 M pH 4. 8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(33 ul/ml腹水),室温下边加边搅拌，4°C澄清I小时，12000 rpm离心20 min,收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小时，3000-5000 rpm离心10 min,收集沉淀，沉淀用少量PBS溶解,透析并更换6次透析液,离心(5000 rpm, 20 min),上清即为纯化后的抗体，其浓度为4. 35 mg 111^,-70 °C冷冻保存。9)单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
采用美国Sigma公司的羊抗鼠IgGl, IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA, IgM标准抗血清，将纯化的腹水抗体作适当稀释后用琼脂双扩散法测定，24h后观察沉淀线，判断单抗的抗体类型及亚类。结果为，IFl的抗体类型及亚类均为IgGl，轻链为kappa链。腹水效价测定以间接ELISA方法测定，操作如下=CIP-OVA交联物lOPg/ml浓度用0. 05mol / L pH 9. 6碳酸盐缓冲液包被ELISA板，每孔lOOul，37°C孵育2h，PBST洗涤3次；用2. 0%脱脂奶封闭，每孔200ul，37°C孵育0. 5h后洗涤3次；倍比稀释的腹水作一抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗涤3次；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，每孔lOOul，37°C孵育Ih后洗涤3次，加入底物溶液，每孔lOOul，37°C孵育15min，加入50ul 2mol/l硫酸终止反应，酶标仪测定0D450值。0D450值为大于阴性抗体的2. I倍时的抗体的最高稀释倍数即为其效价。IFl单抗的ELISA效价达到10_7以上。10)单抗的特异性
采用方阵滴定方法确定间接竞争ELISA抗原抗体最佳工作浓度，在优化的条件下，将环丙沙星标准品、双氢环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、氯霉素、蔗糖、葡萄糖做系列稀释，分别与单抗进行间接竞争ELISA。制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50%的浓度，以及上述几种物质50%抑制率的浓度，然后计算出各类抗生素的交叉反应率。交叉反应率CR计算方法为CR% =环丙沙星IC5tl/其它抗生素IC5tlX 100。如表I所示，单抗与喹诺酮类药物有交叉反应，但与新霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、四环素的交叉反应率均小于0. 01%,说明单抗具有很好的特异性，而且对于喹诺酮类药物，如恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等具有明显的抑制作用，因此，所确定的单抗不单可以检测环丙沙星，亦可检测上述的喹诺酮类药物。表I.单抗的特异性分析
权利要求
1.一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC N O. 5608,其特征在于能分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体。
2.一种如权利要求I所述的杂交瘤细胞株分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达1(Γ7以上,抗体类型及亚类为IgGl、kappa链,该单克隆抗体能与喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星和双氟沙星有特异性免疫反应。
3.—种如权利要求2所述的抗喹诺酮类药物单克隆抗体在食品中该类抗生素残留检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条。
全文摘要
本发明公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用与牛血清白蛋白偶联的环丙沙星(CIP)为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株1F1，其保藏号为CGMCCNo.5608。1F1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。间接竞争ELISA分析表明，该株单抗与环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等喹诺酮类药物有特异反应。利用1F1单抗开发了检测食品中喹诺酮类药物残留的ELISA方法及试剂盒和试纸条。
文档编号G01N33/577GK102618502SQ201210004198
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴建祥 申请人:浙江大学